海洋嗜麦芽寡养单胞菌JX14对锥状斯式藻抑藻机理的研究

摘要

有害藻华是水体中浮游生物大量繁殖产生的一种异常的生态现象，近年来正在向全世界蔓延，并威胁着海洋生物和人类健康，因此，对其控制已成为亟待解决的问题。另外海洋微生物对促进海洋物质循环，维持生态系统稳定具有重要作用，所以越来越多的研究人员开始尝试从微生物角度研究菌的抑藻机理。然而，对抑藻微生物的研究还处于初期阶段，基于分子水平的抑藻机理探讨还不够深入。因此，本论文以赤潮优势藻—锥状斯式藻(Scrippsiella trochoidea)为研究对象，采用分子生物学手段，从藻际抑藻菌株的筛选、抑藻机理的分析、抑藻活性验证三个层面开展了系统研究，主要取得了以下结果： (1)高效抑藻菌株筛选鉴定结果。 藻际分离出180株细菌，筛选获得了8株抑藻细菌，其中具有高效抑藻活性的菌株为JX14，经16S rRNA基因序列鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。 (2)菌株JX14对藻的抑藻机理分析。 在菌株JX14作用下，抑藻效果随菌生物量的增大而增强，藻活性氧(Reactive oxygen species,ROS)活力先显著增高又急剧下降，藻叶绿素含量逐渐下降，藻生物量逐渐下降，而菌生物量逐渐增加，明显降低了藻对营养液无机氮磷的消耗；菌株JX14分泌的弹性蛋白酶、纤维素二糖酶酶活性逐渐提升，对藻细胞的生长具有显著的抑制作用。在藻细胞氧化磷酸化过程中，脱氢酶(Nicotinamide adenine dinucleotide)基因NADH、辅酶Ⅳ系统水分子合成酶基因以及辅酶Ⅲ系统细胞色素b基因Cytb上调，ADP的合成酶基因下调，从而导致藻细胞光合磷酸化电子传递过程受抑制；在藻细胞蛋白输出过程中，信号肽受体蛋白下游基因FtsY下调，能够泛素化降解折叠错误的肽链的基因SEC61α下调，从而导致蛋白输出相关生理过程受到抑制。 (3)抑藻化合物提取结果及活性验证结论。 菌株JX14抑藻方式不是与宿主藻营养竞争，而是以分泌胞外耐高温活性物质及胞外酶类抑藻；获得了抑藻化合物JX-A、JX-B、JX-C、JX-D、JX-E、JX-F、JX-G，含量分别为125mg/L、264mg/L、315mg/L、704mg/L、425mg/L、392mg/L、316mg/L；JX-B、JX-C、JX-D为藻菌共培养过程中菌株JX14持续分泌的同种抑藻化合物JX-B3；且JX-B3处理藻细胞2h以上的最低抑藻浓度为128.3mg/L。

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附表索引

第1章 前言

1.1 选题背景及意义

1.1.1 选题背景

1.1.2 选题意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 赤潮及其防治

1.2.2 藻菌关系

1.2.3 菌抑藻

1.2.4 菌抑藻活性物质

1.3 研究目的及意义

第2章 高效抑藻菌株的筛选

2.1 样品采集

2.2 材料方法

2.2.1 培养基配方

2.2.2 实验仪器

2.2.3 藻华优势藻种分离及传代培养

2.2.4 藻际抑藻菌分离

2.2.5 抑藻率计算

2.2.6 菌DNA提取

2.2.7抑藻菌16S rRNA基因序列鉴定

2.3 结果与分析

2.4 小结

第3章 JX14菌株抑藻机理的研究

3.1 材料方法

3.1.1 实验试剂

3.1.2 培养基配方

3.1.3 实验仪器

3.1.4 共培养藻的准备

3.1.5 共培养菌的准备

3.1.6 藻菌共培养

3.1.7 细菌及藻的计数

3.1.8 藻ROS活力及叶绿素含量测定

3.1.9 间断化学分析仪对无机氮磷含量的测定

3.1.10 菌产酶酶活性变化

3.1.11 藻的RNA 提取及高通量测序

3.1.12 藻的形态观察

3.1.13 数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 藻和菌生物量变化

3.2.2 藻ROS及叶绿素含量变化

3.2.3 共培养液无机氮磷含量变化

3.2.4 菌产酶酶活性变化

3.2.5 菌产酶抑藻活性验证

3.2.6 藻RNA提取及转录组分析

3.2.7 藻的光镜电镜观察

3.3 讨论

(1) 共培养条件下藻正常生理功能受抑制

(2) 菌株JX14 作用下营养盐含量发生变化

(3) 菌株JX14 作用下藻转录表达基因发生变化

(4) 菌株JX14 作用下藻的形态发生变化

3.4 小结

第4章 抑藻化合物提取及活性验证

4.1 材料方法

4.1.1 实验试剂

4.1.2 培养基配方

4.1.3 实验仪器及用品

4.1.4 抑藻方式分析

4.1.5 抑藻化合物提取

4.1.6 抑藻化合物薄层层析检识

4.1.7 抑藻化合物UPLC-MS分析

4.1.8 抑藻化合物活性验证

4.2 结果与分析

4.2.1 抑藻方式确定

4.2.2 抑藻化合物提取UPLC-MS分析结果

4.2.3 抑藻化合物抑藻验证结果

4.3 小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文