RNA干涉与反义RNA技术对植物叶绿体超氧化物歧化酶的功能研究

摘要

本文拟通过农杆菌介导的遗传转化技术，利用含有叶绿体Cu/ZnSODcDNA的反义RNA和RNA干涉载体对烟草进行了转化，产生叶绿体Cu/ZnSOD基因沉默突变体，从而为研究Cu/ZnSOD基因的功能及相关的信号转导途径提供基础。通过对获得的转基因植株进行一系列生理功能分析得到一些结果：　 在本实验中成功构建了三种含有编码番茄叶绿体Cu/ZnSODcDNA的植物双元表达载体。通过农杆菌介导将三种双元表达载体转化到两种烟草中，Nicotianatabacum的14个dsSOD株系和5个antiSOD株系，以及N.plumbaginifolia的58个dsSOD株系和21个antiSOD株系。选取转基因烟草的T1代幼苗进行生理测定和生长分析，比较转化株和野生型的差异。为了研究转基因植株在盐胁迫下的响应，模拟盐浓度逐渐增加的环境对T1代烟草幼苗进行NaCl处理。本文比较了在不同浓度的外源光氧化剂MV诱导下，转基因烟草T1代幼苗叶片的PSⅡ活性、电解质渗漏率等的变化。本文还采用辐射剂量为8.82kJ/m2的UV-B处理转基因烟草T1代幼苗，以及在UV-B辐射的同时加入100mMNaCl进行复合处理，研究转基因植物叶片的PSⅡ活性、叶绿体中过氧化氢生成和抗氧化酶类的变化。

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致谢

缩写词表

摘要

第一章导论

1活性氧的形成与作用

1.1植物细胞中活性氧的形成

1.2活性氧的测定

1.3活性氧在植物细胞中的作用

2植物细胞的抗氧化系统

2.1抗氧化酶类

2.2抗氧化剂类

3叶绿体内活性氧的产生与清除

3.1叶绿体内活性氧的产生

3.2叶绿体的超氧化物清除酶

3.3叶绿体的H2O2清除酶

3.4谷胱甘肽和抗坏血酸循环

4超氧化物歧化酶(SOD)的研究进展

4.1 SOD的性质与功能

4.2 SOD基因的组织特异性表达

4.3环境胁迫与SOD基因的表达调控

4.4影响SOD基因表达的其它因素

4.5 SOD转基因植物与抗逆性

5双链RNA干涉技术(RNAi)的研究进展

5.1RNAi的作用机制

5.2 RNAi应用

5.3前景展望与存在的问题

6本论文的立论依据

第二章材料与方法

1表达载体的构建

2三亲交配法转化根癌农杆菌

3质粒DNA的提取

4限制性内切酶酶切

5回收质粒酶切特定片段

6连接反应

7大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

8重组子的酶切检测

9原核表达

10根癌农杆菌介导的基因转化

11转基因植株的培养

12转基因植株的分子生物学鉴定

13转基因植株的遗传鉴定

14转基因植株与野生型植株的生长与SOD的差异

15胁迫处理

16电解质渗漏率的测定

17叶绿素降解率的测定

18叶绿素荧光的测定

19叶绿体的制备和相关生理指标的测定

第三章结果

1植物表达载体和原核表构建流程图

2植物表达载体的PCR和酶切鉴定

3原核表达分析

4植物表达载体sSOD，antiSOD和dsSOD对烟草的转化

5樱桃番茄的组织培养和转基因植株的获得

6紫花苜蓿的组织培养和转基因植株的获得

7转基因植物的分子生物学鉴定

8转基因烟草T1代的生长与SOD的检测

9胁迫条件下转基因烟草T1代的响应

第四章讨论

1 RNA干涉载体系统的建立

2突变体dsSOD和antiSOD的产生

3 NaCl胁迫下胞质Cu/Zn SOD的增强是叶绿体Cu/Zn SOD缺失的替代途径

4甲基紫精(MV)对光系统Ⅱ活性的抑制与叶绿体Cu/Zn SOD直接相关

5超氧阴离子和过氧化氢介导了增强的UV-B辐射对叶绿体的伤害

结论

参考文献

在读期间已发表和待发表的论文

图版说明