人髓核细胞体外培养及冻存的实验研究

摘要

目的:(1)研究颈椎前路手术术式所取髓核组织中髓核细胞生物学特性,及用于椎间盘髓核组织工程学种子细胞的可行性。(2)探讨适合组织工程学种子细胞的髓核细胞的代次。(3)研究冻存复苏处理是否影响髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白合成及细胞增殖。
　　方法:(1)采用酶消化法提取经颈椎前路手术中取出的人颈椎间盘髓核组织中髓核细胞。(2)对髓核细胞进行体外培养,应用倒置显微镜观察细胞形态变化及生长情况,应用Ⅱ型胶原蛋白免疫组化法对细胞爬片的细胞进行鉴定。(3)应用Image-Pro Plus6.0软件测量传1至5代次髓核细胞免疫组化照片平均光密度,从而观察胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量的差异。(4)按细胞是否做冻存复苏处理分为 A、B两组,A组细胞于-80℃冰箱中冻存2周后复苏的细胞,B组细胞为未经冻存复苏的细胞。应用MTT法分别测量 A、B两组 OD值,从而观察 A、B两组髓核细胞的增殖活力的差异。应用Image-Pro Plus6.0软件对A、B两组髓核细胞免疫组化照片进行平均光密度测量,从而观察在冻存对髓核细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量差异的影响。
　　结果:(1)采用酶消化法可成功分离并培养出人髓核细胞,传1至2代细胞形态呈短梭型、三角形或多边形,传3代以后,细胞形态逐渐变为长梭型;(2)Ⅱ型胶原蛋白免疫组化测得平均光密度值,传1与2代比较差异无统计学意义(P>0.05),传3、4、5代与传1代相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)A组细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白免疫组化测得平均光密度值较B组细胞无明显统计学差异(P>0.05),A组细胞较B组细胞MTT法测OD值无明显统计学差异(P>0.05)。
　　结论:(1)经颈椎前路手术术式取得的髓核组织,可体外培养出的髓核细胞,并可获得传代细胞。(2)传1、2代髓核细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量差异较小,细胞形态分化不明显,适宜做髓核组织工程学种子细胞。(3)冻存复苏处理未能使髓核细胞胞质内Ⅱ型胶原蛋白含量减少,细胞增殖活力亦未降低。

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前言

1 材料

1.1 人髓核细胞来源

1.2 主要实验试剂

1.3 主要仪器设备

1.4 主要试剂的配制

2 方法

2.1 人颈椎间盘髓核细胞的取材与体外培养

2.2 Ⅱ型胶原蛋白免疫组化鉴定

2.3 细胞冻存与复苏

2.4 免疫组化显色的平均光密度值测定

2.5 MTT法测OD值

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 髓核细胞鉴定

3.2 原代髓核细胞生长特点

3.3 传代髓核细胞的生长特点

3.2 不同代次髓核细胞免疫组化显色的平均光密度值

3.3 冻存复苏处理对髓核细胞的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

参考文献

致谢

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