蛇葡萄素及其联合卡铂对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用及机理研究

摘要

研究背景和目的： 黄酮类化合物(flavanoids)主要泛指两个苯环(A环和B环)通过三个碳原子相互连接而成的一大类化合物，是广泛分布于植物体根、叶、皮、果实，以及水果、蔬菜中的低分子多酚类物质，在植物体内多以游离态或/与糖结合成甙的形式存在。由于糖的种类及连接位置不同，形成多种黄酮苷，其中主要有黄酮类、黄酮醇类、黄烷醇类、异黄酮类、双黄酮类、二氢黄酮及相应的醇类。常见的黄酮类化合物有槲皮素、儿茶素、芹菜黄素、橙皮素、金雀异黄素、蛇葡萄素等。黄酮类化合物具有广泛的药理活性。大量研究表明，黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗过敏、抗炎症、抗病毒等多种生物活性及药理作用，对人类的肿瘤、衰老、心血管等疾病的治疗和预防具有重要意义[1-3]，鉴于此，黄酮类化合物成为了目前研究的热点。 蛇葡萄素(Ampelopsin，Amp)属于小分子黄酮类化合物，是从蛇葡萄属植物的根和全株提取得到。国外的研究证明，长期食用富含黄酮类化合物的食物，可以降低心脑血管疾病如冠心病、心肌梗死和老年性痴呆发病率，同时降低以上疾病的死亡率[4-5]。近年来研究发现，蛇葡萄素为酪氨酸酶抑制剂[6]，体内对C57BL/6小鼠B16黑色素瘤有抑制生长的作用[7]，对人肺癌GLC-82裸鼠移植瘤、小鼠皮下移植的小鼠肺腺癌细胞Lewis，有抑制生长的作用[7]，在体外对人早幼粒白血病HL60，慢性粒细胞白血病K562，人鼻咽癌HK-1，人肝癌BEL7402，人乳腺癌MCF7等肿瘤细胞株的增殖有显著的抑制作用[8-10]。 本课题通过蛇葡萄素单用和与卡铂联用，研究蛇葡萄素对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用，并进一步观察了对肿瘤细胞形态学、细胞凋亡及细胞周期、基因表达和离子稳态的影响，从诱导细胞凋亡途径初步研究了其作用机理；同时研究了蛇葡萄素对卡铂的协同作用，为蛇葡萄素早日进入临床试验提供了实验依据。 方法 1、应用MTT比色法测定蛇葡萄素单用和与卡铂联用对人肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用，同时观察是否存在剂量和时间依赖性。 2、用HE染色和透射电镜观察蛇葡萄素单用和与卡铂联用引起的人肺腺癌细胞A549的形态学变化。 3、通过流式细胞仪(FCM)分析细胞周期和凋亡率，用免疫细胞化学法研究对诱导细胞凋亡基因bax和抑制细胞凋亡基因bcl-2表达的影响。 4、用激光共聚焦显微镜(LSCM)测定A549细胞内[Ca2+]、[H+]和线粒体膜电位的变化。 结果 1、蛇葡萄素在12.5～200μg/ml范围内，随着浓度的增大，抑制作用明显增强；随时间的延长，其抑制率有增高的趋势。蛇葡萄素在25、50、100μg/ml与卡铂联用使卡铂的抑制作用明显增强，IC50明显降低，有明显的协同效应。形态学观察表明，单用蛇葡萄素有诱导细胞凋亡的作用，蛇葡萄素100μg/ml与卡铂联用，出现明显的凋亡晚期特征即凋亡小体。 2、FCM分析显示，单用蛇葡萄素25、50μg/ml处理细胞48h后，凋亡率为0.5±0.01％、3.57±0.45％，与阴性组(0.17±0.12)比较，具有统计学意义(P＜0.01)；蛇葡萄素25、50、100μg/ml分别加卡铂25μg/ml处理细胞48h后，其凋亡率分别为7.83±0.74％、16.97±1.20％、22.82±6.05％，与卡铂单药组(13.86±1.10％)比较，蛇葡萄素50、100μg/ml加卡铂25μg/ml时，凋亡率增高(P＜0.05)。单用蛇葡萄素主要阻滞细胞于G0/G1期。蛇葡萄素25μg/ml加卡铂25μg/ml，细胞仍然被阻滞于G0/G1期；蛇葡萄素50μg/ml加卡铂25μg/ml与单用卡铂25μg/ml对细胞周期的作用相似，细胞阻滞于S期；蛇葡萄素100μg/ml加卡铂后，细胞G0/G1、S期同时被阻滞，显示了强烈的协同作用。 3、与阴性组比较，蛇葡萄素50、100μg/ml时，细胞内[H+]明显升高(P＜0.01)，线粒体膜电位明显降低(P＜0.05)；蛇葡萄素100μg/ml时，[Ca2+]显著升高(P＜0.01)；蛇葡萄素(25、50、100μg/ml)加卡铂处理A549细胞，与卡铂组比较，蛇葡萄素(100μg/ml)加卡铂处理组细胞内的[Ca2+]、线粒体膜电位升高(P＜0.05)，[H+]变化无明显差异(P＞0.05)；与单用蛇葡萄素(100μg/ml)比较，蛇葡萄素(100μg/ml)加卡铂处理组细胞内的[Ca2+]下降(P＜0.05)。4、蛇葡萄素50、100μg/ml处理细胞48h后，bax表达显著提高(P＜0.01)，bcl-2的表达降低(P＜0.01)，使bax/bcl-2比率提高；与卡铂组比较，蛇葡萄素25、50、100μg/ml分别加卡铂25μg/ml处理细胞48h后，细胞内bax表达显著提高(P＜0.01)。bcl-2表达降低不明显(P＞0.05)，提示联合用药可提高bax/bcl-2比率。结论： 1、单用蛇葡萄素和蛇葡萄素加卡铂在一定浓度范围内对A549细胞的生长有显著的抑制作用。 2、蛇葡萄素有明显的诱导A549细胞凋亡的作用，且阻滞细胞于G0/G1期。 3、蛇葡萄素25、50、100μg/ml加卡铂25μg/ml对肺腺癌A549细胞凋亡具有明显的协同作用。 4、单用蛇葡萄素或蛇葡萄素加卡铂诱导A549细胞凋亡的途径与提高Bax/Bcl-2的比率有关。 5、在一定浓度下，单用蛇葡萄素能降低A549细胞线粒体膜电位，提高Ca2+、H+离子浓度。高剂量蛇葡萄素(100μg/ml)加卡铂(25μg/ml)降低了A549细胞内Ca2+浓度，提高了线粒体膜电位。

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材料

研究方法

研究结果

三、讨论

四、结论

参考文献

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