胆汁中33.5kDa泡相蛋白的分离纯化

摘要

胆汁中的33.5kDa泡相蛋白 (33.5kDa vesicular protein) 是1998年由马保金等人从胆固醇结石患者胆汁中分离纯化出的。其蛋白浓度为0.46±0.06mg/ml，约占胆汁总蛋白量的0.552﹪。尽管33.5kDa泡蛋白含量甚微，却具有显著的促成核作用，通过测定得出成核活性强达0.310，是迄今发现活性最强的成核效应蛋白。寻找最强促成核活性蛋白，可用于研制诊断试剂盒判断和预测胆石发生、发展趋势。 本实验采用了高速离心、离子交换层析、分子筛层析等方法，来寻找一条快速方便经济的分离纯化胆汁中33．5kDa泡相蛋白的方法。在此基础上可以利用纯化的33.5kDa泡相蛋白制备单克隆抗体从而利用EIASA的原理制成胶体金快速诊断试剂盒用来检测蛋白作为普查诊断的标准。 实验首先采用了离子交换层析，尝试了阴离子、阳离子两种填料，经过四个pH条件的摸索得出目的蛋白应为酸性蛋白，对离子交换层析填料吸附性强，难于洗脱。之后，采用Phenvl-Sepharose Fast Flow，由于胆汁中胆红素可能疏水性更强，从而目的蛋白不能够有效的挂在填料上，而且对填料的损坏也很严重。最后通过高速离心结合分子筛层析的方法得到了电泳纯的蛋白样品，利用得到的蛋白样品进行了模拟胆汁成核的活性测定，实验结果说明分离到的蛋白有成核活性，经RP-HPLC进行纯度鉴定，目的蛋白纯度基本可以。还需进一步实验分析样品是否是我们的目的蛋白。

目录

声明

缩略词

第一部分前言

1.胆囊

1.1胆囊的功能

1.2胆汁

2.胆石症的概况

2.1胆石症的现状

2.2胆结石的分类

2.3引发胆石症的因素

2.4胆石症的临床表现

2.5胆结石的诊断

2.6胆结石病的危害性

3.胆石症的治疗

4.胆固醇结石的成因

5.胆汁成核效应蛋白的研究进展

5.1促成核蛋白主要有以下几种

5.2抑制成核蛋白

6.单克隆抗体的应用

6.1单克隆抗体的特点

6.2单克隆抗体在医学检验上的应用

6.3单克隆抗体在临床治疗上的应用

6.4国内外单抗研究现状

7.ELISA诊断方法的原理及研究进展

7.1 EIA的特点与发展趋势

7.2 ELISA的原理

7.3 ELISA的应用

8.免疫胶体金技术的基本原理

9.课题意义及目的

第二部分实验部分

1.实验材料

1.1 原料

1.2模拟胆汁的配制原料

1.3其他试剂

1.4仪器与设备

1.5计算机分析软件

2.实验主要试剂的配制

2.1不同pH的不同浓度的磷酸缓冲液的配制

2.2不同浓度pH3.0甘氨酸-盐酸缓冲液的配制

2.3不同浓度pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液的配制

2.4不同浓度pH9.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的配制

2.5含150mmol/LNaCl的20mmol/L Tris-HCl的pH7.4 TBS的配制，100ml

2.6 10mmol/L STDC-TBS溶液的配制,10ml

2.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制

2.8模拟胆汁的配制

3.离子交换柱分离蛋白

4.疏水层析法分离蛋白

5.分子筛层析法分离蛋白

6.RP-HPLC的使用

第三部分结果与分析

1.层析条件的选择

1.1离子交换层析填料的选择

1.2分析调pH到3的透析后胆汁上清和沉淀

1.3对于胆汁中胆色素的处理

1.4分析不同填料上样后平衡时洗出的蛋白

2.33.5kDa泡相蛋白的活性测定

2.1第一次活性测定

2.2第二次活性测定

2.3第三次活性测定

3.模拟胆汁成核过程是微图示

4.分子筛层析分离的胆汁进行HPLC分析

4.1梯度洗脱

4.2恒浓度洗脱

第四部分总结

参考文献：

致 谢