中国不同环境中嗜酸浸矿细菌的分子系统学研究

摘要

包括32个中国的Acidithiobacillus spp．野生菌株、3个参比菌株以及GenBank数据库中搜索到的具有代表性的其它相关菌株的16S rRNA基因序列和转录间隔序列(ISR)构建进化树。所有的Acidithiobacillus spp．菌株被划分为三个系统学大群(Cluster)、8个系统学组(Group)。 研究表明，ISR序列的差异是种特异的，即每个种之间有明显的差异。8个Acidithiobacillus thiooxidans菌株的间隔序列大小在451～465bp之间，22个Acidithiobacillusferrooxidans菌株大小在440～456bp之间，唯一的例外是菌株BY-3，间隔序列大小仅有434bp。未鉴定到种水平的5个Acidithiobacillus菌株，具有明显不同的间隔序列，其中DBS-2、TSK-3间隔序列最小只有413和416bp，菌株YP-5、FY-2、DBS-4间隔序列都为421bp。同一个种内，菌株之间间隔序列(ISR)大小差异不超过3％。在种内序列之间的相似性明显高于种之间菌株的相似性系数，不同种的菌株之间的相似性系数在60.49％～84.71％，A．thiooxidans和A．ferrooxidans 种内不同菌株之间的相似性系数分别在86.71～99.56％、92.36％～100％。在所有的Acidithiobacillus spp．菌株的ISR序列中，序列最主要的差异，包括长度、组成差异，主要集中在ISRc区。 A．ferrooxidans被归属于三个不同的系统学组，其中中国分离的20个A．ferrooxidans菌株分别被归属于Groupl和Group2。研究表明，三个不同的系统学组菌株拥有明显不同大小的ISR序列，分别为440～441bp(Groupl)、448～456bp(Group2)、452～456bp(Group3)。菌株ATCC23270<'T>、SSP、ATCC33020分别作为三个系统学组的代表菌株，序列比较显示三个A．ferrooxidans 系统学组的菌株有很显著的序列差异。遗憾的是所分离的20个A．ferrooxidans菌株中，没有隶属于系统学Group3的菌株。很可能每个系统学组代表了不同的亚种(subspecies)或者不同的种(species)。 此外，对A．ferrooxidans来说，依据表型特征的生理学分群与依据RAPD、rep-PCR、ARDREA综合的分子遗传分型、以及依据16r RNA基因序列和转录间隔序列(ISR)的系统发育研究结果之间存在明显的相关性。在5个生理学组之中，尘理学组GroupA和B共同构成了基因组型(genotypic)Group Ia，这个组的菌株在温度40℃或者pH1.3的条件下不能生长或者生长的很差，而且氧化硫单质的能力很差，相对不耐酸，最低生长pH值为1.5；而生理学组(physiological)Group C、D、E分别对应于基因组型Ib、Ic、Id，其中Group C的菌株能够在温度40℃或者pH 1.3的条件下生长，而且氧化单质硫的速度较快；菌株BY-3 and DX-2和构成了生理学组 Group D、E，前者不仅可在40℃生长，而且可在pH 1.2生长，后者虽然也可以在40℃生长，但在pH 1.3时不能生长。同样发现，A．ferrooxidans的生理学分组与16SrRNA基因的系统学研究之间也存在明显的相关性，属于生理学组Group C、D、E的菌株大多被划入系统学组Group 1中，而生理学组GroupA、B的菌株归属于系统学组Group 2。一个例外就是，A．ferrooxidans strains HNQ 和TGS属于生理学组Group C，却在遗传分型中归属于Group Ia。五个未鉴定到种的菌株中，Acidithiobacillus DBS-2，TSK-3构成了系统学Group8，DBS-4、FY-2、YP-5构成了另一个组(Group7)。大小明显不同的间隔序列(ISR)及表型特征的差异，说明这五个菌株很可能代表着与A．ferrooxidans 和A．thiooxidans进化关系稍远的Acidithiobacillus属的两个新种，或者组成一个不同的新属。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章微生物湿法冶金技术及嗜酸浸矿微生物

1.1微生物湿法冶金技术

1.1.1关于微生物湿法冶金技术的几个概念

1.1.2微生物湿法冶金的类型及现状(Rawlings et al.,2002,2003)

1.1.3微生物生物氧化的机理(Rohwerder et al .,2003,Rawlings et al.,2004)

1.2嗜酸微生物与主要的嗜酸浸矿细菌的多样性

1.2.1概述

1.2.2嗜酸微生物多样性

1.2.3目前与微生物湿法冶金相关的主要嗜酸原核生物

1.3嗜酸浸矿原核生物的分类学、系统学研究

1.3.1细菌分类学及系统学研究方法

1.3.2常见嗜酸细菌及浸矿细菌分类学及第统学研究

1.4浸矿细菌的遗传多样性研究进展

1.5自然环境和工业浸矿实践中嗜酸微生物的分子生态学研究

1.5.1微生物分子生态学研究的一般方法和原理

1.5.2分子生物学技术在嗜酸浸矿微生物分子生态学研究中的应用

1.5.3自然环境和工业浸出实践中嗜酸浸矿细菌的群落结构组成

1.6本论文的立论依据及其主要研究内容

1.6.1硫杆菌(Thiobacillus)及其它嗜酸浸矿细菌分子系统学研究目标及意义

1.6.2不同环境中嗜酸浸矿细菌的遗传多样性研究及其意义

参考文献

第二章硫杆菌及其它浸矿微生物的分离、纯化、筛选

2.1材料与方法

2.1.1采样点

2.1.2采样方法

2.1.3细菌的分离纯化

2.1.4培养基方案

2.2结 果

2.2.1实验分离菌株及模式菌株、参比菌株

2.2.2分离细菌的形态学及生理学初步鉴定

2.3讨 论

参考文献

第三章硫杆菌及其它浸矿细菌的生理生化性状

3.1材料与方法

3.1.1形态学观察

3.1.2浸矿细菌的生理多样性

3.2结 果

3.2.1形态学显微镜观察

3.2.2浸矿细菌的生理多样性

3.3讨 论

参考文献

第四章氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)遗传多样性研究

4.1材料与方法

4.1.1供试菌株及参比菌株

4.1.2细菌DNA的制备

4.1.3随机扩增多态性分析(RAPD，random amplified polymorphic DNA)和AP-PCR

4.1.4扩增16S rDNA及ITS序列限制性酶切分析(ARDRA,aplified ribosomal DNA restriction analysis)

4.1.5 rep-APD(repetitive primer amplified polymorphic DNA)

4.1.6数掘处理

4.1.7根据16S rDNA及16S-23S ISR间隔序列的系统学分析

4.2结 果

4.2.1细菌DNA的制备

4.2.2随机扩增多态性分析(RAPD,random amplified polymorphic DNA)

4.2.3扩增16S rDNA及ISR序列限制性酶切分析(ARDRA，aplified ribosomal DNA restriction analysis)

4.2.4 rep-APD和AP-PCR的聚类分析mplified polymorphic DNA)

4.2.5 16S rRNA基因及ISR间隔序列的系统学分析

4.3讨 论

4.3.1不同分子分型技术的分辩指数比较

4.3.2 Acidithiobacillus spp.遗传多态性形成的原因分析

4.3.3 Acidithiobacillus spp.遗传分型与生理学分组之间的相关性

参考文献

小 结

致 谢

附 图