蛋白质分子印迹核-壳微球的研究

摘要

分子识别是生命过程的一种重要活动，分子印迹技术就是模拟天然分子的识别功能制备具有特异选择性聚合物的人工方法。经过人们的不懈努力，这方面的工作已取得了重大进步，特别是在小分子印迹方面，实验所需的各种方法和手段日臻完善，印迹聚合物的制备技术渐趋成熟，相关的许多应用研究正在逐步展开。但是对于生物大分子比如蛋白质分子，目前所采用的方法不理想，实验结果重现性差，水环境下的识别机理还不清楚，生物大分子在聚合物中扩散慢。因此，有必要对生物大分子印迹技术进行进一步的研究，这对大分子印迹材料在催化领域、物质分离、生物制药、分析化学和生物传感等应用方面具有重要意义。 本文首先对分子印迹技术的基本原理、应用和研究现状进行了论述。分子印迹技术来源于免疫学。1993年，Mosbach等在《Nature》上发表了有关茶碱分子印迹物的研究报道之后，分子印迹技术才得到了蓬勃发展。该技术的基本原理为：在制备分子印迹聚合物时，功能单体与模板分子通过一定的作用力结合在一起，引发聚合后模板分子被包埋在聚合物内部。当模板分子从聚合内部洗脱之后，聚合物中留下一些位点，这些位点能够记忆模板分子的功能和形状。分子印迹分为两种基本类型：预组织法(共价法)和自组织法(非共价法)。分子印迹聚合物在色谱分离、仿生催化、药物分析及分析传感等方面展现出良好的应用。分子印迹技术研究正从以小分子为模板向生物大分子为模板发展。目前用于印迹的蛋白质种类多种多样，较为常用的有牛血清蛋白(BSA)、牛血红蛋白、核糖核酸酶和溶菌酶等。对蛋白质印迹目前常采用的单体有丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、N，N'-乙烯基二丙烯酰胺，N,N'-亚甲基二丙烯酰胺等。蛋白质分子印迹聚合物的物理形式可大致分为三维块体和二维薄膜两种。 主要研究内容是制备聚苯乙烯微球，在水溶液环境条件下制备核-壳结构的蛋白分子印迹微球。通过再结合实验考察所制备的印迹微球的特异结合能力和分子识别性能等，并对蛋白质分子的印迹和识别原理进行了分析。 首先，从各种制备微球的方法中，探索出了用悬浮聚合法制备聚苯乙烯微米级球体技术，考察了聚合温度、搅拌速率、引发剂用量、单体用量、表面活性剂浓度等条件对微球形貌的影响，并利用扫描电镜对微球的表观形貌、粒径及粒径大小分布进行了表征。实验结果表明，在适当条件下，悬浮聚合法可以制备出粒径在50-60微米的球体。该方法制备的聚苯乙烯微球大小较均匀、表面清洁，所需反应时间短、操作方便、产品易于分离。其次，在水溶液中于聚苯乙烯微球表面通过化学氧化法嫁接一层聚间氨基苯硼酸薄膜，形成核-壳结构微球。在此实验部分主要研究了乙酸溶液和磷酸缓冲溶液对嫁接的聚间氨基苯硼酸薄膜稳定性的影响。并用透射电镜、拉曼光谱、X-射线光电子能谱和氮气吸附，脱附实验对核．壳结构微球进行了表征。实验证明，聚间氨基苯硼酸通过苯环上的电子成对作用较牢固地结合在聚苯乙烯微球表面；核．壳微球在乙酸溶液和磷酸缓冲溶液中有很高的稳定性。 再次，在制备核．壳微球的基础上，当蛋白分子参与嫁接过程时实现了蛋白质分子印迹。为了验证方法的可行性，我们首先以溶茵酶作为模板分子进行印迹。先将一定浓度的间氨基苯硼酸溶液和溶茵酶溶液相混合，使蛋白分子与功能单体相互作用，然后加入一定量的聚苯乙烯微球和一定浓度的过硫酸铵溶液，在22-24℃下进行聚合反应。反应完成后将印迹的微球从溶液中分离出来，并用去离子水洗涤。干燥一定时间后，用乙酸溶液洗涤除去模板分子，再于室温下进行干燥。用干燥的微球进行间歇式吸附实验，考察印迹微球达到吸收平衡的时间。结果表明该印迹微球可以在60 min内达到吸收平衡，证明该微球对生物大分子具有较好的质量传输性能；印迹微球对模板分子的特异吸附性能实验表明，当实验达到吸收平衡时印迹微球比非印迹微球有较大的吸附能力；分子识别性能实验显示，印迹微球对模板分子有较强的结合能力。另外还考察了这种印迹微球的稳定性，实验表明其稳定性在两个月内没有明显变化。 最后，利用这种原理分别制备了其它蛋白质(牛血红蛋白、牛血清蛋白、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等)的印迹微球，用多种方法对样品进行了表征，并考察了印迹微球的特异吸附能力和识别性能及质量传输性能和稳定性等。 总之，实验表明我们制备的蛋白质印迹核-壳结构微球有较快的质量传输性能，对模板分子有高的吸附能力和良好的选择性识别性能。该分子印迹技术方法简便、反应条件温和，可以在水溶液环境中实现蛋白分子的印迹和识别，并具有一定的普适性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章分子印迹研究进展

1.1分子印迹起源

1.2分子印迹技术的原理和方法

1.2.1预组织法

1.2.2自组织法

1.3分子印迹聚合物的特点

1.4分子印迹技术的热力学和动力学

1.4.1分子印迹技术热力学

1.4.2分子印迹技术动力学

1.5分子印迹合物的制备方法

1.5.1分子印迹聚合物的制备过程

1.5.2分子印迹聚合物的制备

1.6分子印迹聚合物的物理形式

1.6.1块体分子印迹聚合物

1.6.2微米和纳米级的球状分子印迹聚合物

1.6.3棒状分子印迹聚合物

1.6.4薄膜状分子印迹聚合物

1.7分子印迹物的表征

1.7.1化学表征

1.7.2形貌表征

1.7.3分子识别行为表征

1.8分子印迹聚合物的应用

1.8.1分子印迹技术在化学反应中的应用

1.8.2分子印迹聚合物在提取分离中的应用

1.8.3分子印迹聚合物在分析化学中的应用

1.9分子印迹物的发展趋势

1.9.1从小分子向生物大分子的发展

1.9.2从三维到二维的发展

1.10结论和本论文的研究思路及意义

参考文献

第二章无皂乳液聚合法制备聚苯乙烯微球

2.1绪言

2.2实验部分

2.2.1主要试剂与仪器

2.2.2聚苯乙烯微球的制备

2.3结果与讨论

2.3.1离子强度对粒径的影响

2.3.2单体浓度对粒径的影响

2.3.3引发剂浓度对微球粒径的影响

2.3.4搅拌速率对微球粒径的影响

2.4结论

参考文献

第三章悬浮聚合法制备聚苯乙烯微球

3.1绪言

3.2实验部分

3.2.1试剂和仪器

3.2.2苯乙烯微球的制备

3.2.3样品形貌分析

3.3结果与讨论

3.3.1聚合条件对苯乙烯微球形貌的影响

3.3.2代表性样品形貌分析

3.4结论

参考文献

第四章核-壳微球的制备、表征及稳定性研究

4.1绪言

4.2实验部分

4.2.1主要试剂和仪器

4.2.2聚苯乙烯微球的制备

4.2.3聚苯乙烯微球的表面嫁接

4.2.4样品表征

4.2.5稳定性实验

4.3结果与讨论

4.3.1制备核-壳微球的反应原理

4.3.2样品表观形貌分析

4.3.3样品拉曼光谱分析

4.3.4 X射线光电子能谱分析

4.3.5 N2物理吸附-脱附分析

4.3.6嫁接层稳定性研究

4.4结论

参考文献

第五章溶菌酶分子印迹核-壳结构微球的制备及性能研究

5.1绪言

5.2实验部分

5.2.1主要试剂和仪器

5.2.2聚苯乙烯微球的制备

5.2.3溶菌酶印迹聚合物微球的制备

5.2.4样品的表征

5.2.5蛋白吸附实验

5.3结果和讨论

5.3.1聚苯乙烯微球扫描电镜分析

5.3.2样品的透射电镜分析

5.3.3样品的FT-Raman散射光谱分析

5.3.4X-射线光电子能谱分析

5.3.5氮气物理吸附-脱附分析

5.3.6吸附平衡时间

5.3.7印迹微球对模板蛋白溶菌酶的再结合能力和特异结合性能

5.3.8核-壳印迹微球对模板蛋白溶菌酶的识别能力

5.3.9印迹微球的交叉反应性能和评价

5.3.10溶菌酶印迹微球的稳定性

5.4结论

参考文献

第六章牛血红蛋白分子印迹核-壳结构微球的制备及性能研究

6.1绪言

6.2实验部分

6.2.1主要试剂和仪器

6.2.2牛血红蛋白印迹核-壳微球的制备

6.2.3样品的表征

6.2.4蛋白吸附实验

6.3结果和讨论

6.3.1样品的透射电镜分析

6.3.2氮气物理吸附-脱附分析

6.3.3样品的FT-Raman散射光谱分析

6.3.4X-射线光电子能谱分析

6.3.5 pH对再结合蛋白的影响

6.3.6再结合动力学研究

6.3.7印迹微球对牛血红蛋白模板再结合特异性能

6.3.8核-壳印迹微球对牛血红蛋白模板的识别能力

6.3.9印迹微球的交叉反应

6.3.10牛血红蛋白印迹微球的稳定性

6.4结论

参考文献

第七章牛血清蛋白分子印迹核-壳结构微球的制备及性能研究

7.1引言

7.2实验部分

7.2.1主要试剂和仪器

7.2.2牛血清蛋白印迹聚合物微球的制备

7.2.3样品表征

7.2.4蛋白吸附实验

7.3结果和讨论

7.3.1样品的FT-Raman散射光谱分析

7.3.2X-射线光电子能谱分析

7.3.3 pH对再结合蛋白的影响

7.4结论

参考文献

第八章木瓜酶分子印迹核-壳微球的制备及性能研究

8.1引言

8.2实验部分

8.2.1主要试剂和仪器

8.2.2木瓜酶印迹核-壳微球的制备

8.2.3样品的表征

8.2.4蛋白吸附实验

8.3结果和讨论

8.3.1样品的透射电镜分析

8.3.2氮气物理吸附-脱附分析

8.3.3样品的FT-Raman散射光谱分析

8.3.4X-射线光电子能谱分析

8.3.5溶液pH对印迹微球吸附蛋白能力的影响

8.3.6印迹微球吸附蛋白分子的动力学性能

8.3.7印迹微球对木瓜酶模板蛋白再结合特异性能

8.3.8核-壳印迹微球对木瓜酶模板蛋白的识别能力

8.3.9木瓜酶印迹微球的稳定性

8.4结论

参考文献

第九章胰蛋白酶分子印迹核-壳微球的制备及性能研究

9.1绪言

9.2实验部分

9.2.1主要试剂和仪器

9.2.2胰蛋白酶印迹核-壳微球的制备

9.2.3样品的表征

9.2.4蛋白吸附实验

9.3结果和讨论

9.3.1样品的透射电镜分析

9.3.2样品的FT-Raman散射光谱分析

9.3.3X-射线光电子能谱分析

9.3.4印迹微球再结合动力学研究

9.3.5印迹微球对模板蛋白(胰蛋白酶)再结合特异性能

9.3.6核-壳印迹微球对模板蛋白(胰蛋白酶)的选择识别能力

9.3.7印迹微球的交叉反应性能和评价

9.3.8胰蛋白酶印迹微球的稳定性

9.4结论

参考文献

第十章结论和展望

10.1结论

10.2创新点

10.3待解决的问题

10.4蛋白分子印迹技术展望

在学期间的研究成果

致谢