NELL-1基因转染的BMSCs和ADSCs成骨向分化能力的比较研究

摘要

目的：比较Nel样I型分子（NELL-1）基因转染后自体大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）和脂肪来源干细胞（rADSCs）的成骨向分化能力。
　　方法:分离大鼠股骨、胫骨骨髓及附睾处脂肪组织，通过全骨髓贴壁培养法及改良酶组织块消化法分离获得原代 BMSCs和ADSCs并进行传代，通过茜素红染色和油红 O染色鉴定第三代细胞的多向分化特性；以脂质体为载体，分别搭载NELL-1质粒和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）质粒作为同种细胞实验组和对照组，转染第三代BMSCs和ADSCs；两种细胞间，脂质体/NELL-1质粒复合物转染的BMSCs和ADSCs互为对照。通过流式细胞仪测定脂质体介导质粒转染细胞效率；采用MTT法检测NELL-1基因在不同时间对 BMSCs和ADSCs增殖活性的影响；在成骨诱导条件下，通过碱性磷酸酶（ALP）活性测定、茜素红染色及Real-time PCR，观察NELL-1基因对同种干细胞分化及功能的影响，及两种细胞之间成骨向分化能力的比较。
　　结果：
　　1.倒置显微镜下观察原代细胞贴壁生长，传代至第三代时细胞形态逐渐均一，表现为成纤维细胞样，呈漩涡状、辐射状排列，并形成集落；矿化液持续诱导培养21天，茜素红染色后可见细胞团中央橘红色钙结节形成，成脂诱导28天，油红O染色观察细胞质内亮红色脂滴形成。
　　2.在脂质体/质粒质量比为4:1时，流式细胞仪检测两种细胞转染效率分别为：ADSCs：2.86％，BMSCs：1.75％。
　　3.MTT试验显示转染后第1-3天同种细胞实验组与对照组细胞增殖情况对比无统计学差异。
　　4.RT-PCR结果显示成骨诱导第3天、7天，同种细胞实验组Runx2、COL1、ALP的mRNA表达较对照组升高，3天BMSCs中实验组SP7表达无明显改变；两种细胞对比，ADSCs成骨因子mRNA表达水平显著低于BMSCs，差异有统计学意义。成骨诱导第7天，同种细胞中实验组检测ALP活性较对照组明显升高；两种细胞对比，ADSCs表达ALP活性明显低于BMSCs。成骨诱导第21天在倒置显微镜下观察同种细胞在同一视野下实验组钙结节生成数量较对照组大而多，且定量结果显示实验组OD值较对照组大，有统计学差异；两种细胞对比，ADSCs钙结节生成数量较BMSCs大而多，且定量显示ADSCs OD值较BMSCs大，差异有统计学意义。
　　结论：脂质体介导 ADSCs转染效率高于 BMSCs，NELL-1基因能有效促进大鼠ADSCs和BMSCs成骨向分化及矿化功能。基因转染后，ADSCs成骨潜能仍不如BMSCs。

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前言

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

1.2 实验使用主要仪器

1.3 试剂配制

1.4 实验方法

1.5 统计学方法

2结果

2.1 细胞形态学观察和鉴定

2.2质粒扩增鉴定

2.3转染效率测定

2.3 转染liposome/pNELL-1对ADSCs和BMSCs增殖的影响

2.4 实时定量PCR

2.5 ALP活性测定

2.6 茜素红染色及定量

3讨论

4结论

参考文献

综述: 脂肪干细胞应用于骨组织工程的研究进展

致谢

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