有机磷杀虫剂毒死蜱经氧化胁迫诱导小鼠视网膜细胞凋亡及维生素C和E的联合保护作用

摘要

有机磷杀虫剂毒死蜱(CPF)在全球农业生产和公共卫生项目中的广泛使用，已经引起了严重的环境污染和健康危害，包括急、慢性人类中毒。视网膜也是CPF作用的靶器官之一。但目前对其中毒机制还不十分明了。以前的研究主要侧重于CPF对视网膜细胞中乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。本研究主要是探讨CPF能否诱导小鼠视网膜细胞产生氧化胁迫并致其凋亡，而联合应用维生素C和E对CPF的视毒性是否有抑制作用。 试验小鼠被随机分成4组(每组20只)：对照组(Control)；维生素C加维生素E处理组(VC+VE)；毒死蜱处理组(CPF)：和CPF加维生素C和维生素E处理组(CPF+VC+VE)。VC+VE组和CPF+VC+VE组用维生素C 250 mg/kg和维生素E150mg/kg预处理，皮下注射，每天1次，持续6天。其它组同时皮下注射生理盐水。之后，CPF组和CPF+VC+VE组通过强迫饲喂给予CPF(63 mg/kg)，该剂量为半致死剂量的1/4。 在CPF处理24小时后，所有的鼠麻醉后被杀死，摘除视网膜。部分视网膜被用来做电镜标本，观察其细胞的形态学改变，以及用共聚焦显微镜检测钙离子浓度。部分视网膜被分离成单细胞悬液进行彗星电泳，AO/EB双重染色，以及用流式细胞仪检测细胞凋亡。剩余的视网膜被制成匀浆用来检测丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活性，过氧化氢酶(CAT)活性，谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性。 结果显示：CPF组小鼠视网膜细胞中产生了脂质过氧化，DNA损害程度增强，部分细胞发生凋亡，同时抗氧化酶SOD、CAT和GPX的活性降低，而抗氧化剂维生素C和E的联合使用则可以明显抑制CPF的这些细胞毒作用，这说明CPF所诱导的小鼠视网膜细胞凋亡确实是由氧化胁迫造成的。我们还观察到，CPF还可以抑制小鼠视网膜细胞中的AChE活性，并促进其胞内钙离子浓度增加，而联合应用维生素C和E，对这些作用具有明显和有效的抑制效果。 我们的结果说明：①有机磷杀虫剂CPF可经由氧化胁迫途径诱导小鼠视网膜细胞凋亡，在该过程中CPF降低了AChE活性并增加了细胞内钙离子的浓度。本研究结果有助于进一步阐明CPF和其它有机磷杀虫剂引起中毒的机制；②外源性抗氧化剂维生素C和E的联合应用，明显地降低了CPF对小鼠视网膜细胞的损害作用。上述研究结果提示，在临床治疗有机磷杀虫剂引起的视毒性时，除了使用传统的解毒剂进行治疗外，如果再结合使用维生素C和E的抗氧化治疗，也许会收到更好的效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1有机磷杀虫剂

1.1.1产量、用途、接触及使用情况

1.1.2中毒概况

1.1.3 OPI对人与动物的影响

1.2 OPI中毒视网膜损伤机制

1.2.1 AChE机制

1.2.2氧化胁迫机制

1.3维生素C和维生素E的保护作用

1.3.1维生素C的生物功能

1.3.2维生素C的抗氧化作用

1.3.3维生素E的分子结构、生理活性和主要功能

1.3.4维生素E的抗氧化作用

1.3.5维生素C或维生素E缺乏与眼疾病

1.3.6维生素C和维生素E的联合抗氧化作用

1.3.7有关维生素C和维生素E的使用剂量

1.4 OPI与细胞凋亡

1.4.1细胞凋亡的概念

1.4.2细胞凋亡的生物学特征

1.4.3 OPI诱导细胞凋亡机制

1.4.4 OPI诱导细胞凋亡的判断依据

1.5毒死蜱的毒理学研究进展

1.5.1毒死蜱的概念

1.5.2 CPF的分子式及结构式

1.5.3 CPF的理化性质及用途

1.5.4 CPF的生物代谢

1.5.5 CPF对脑细胞发育的影响

1.5.6 CPF的致畸性

1.5.7 CPF对人类志愿者的实验结果

1.5.8 CPF在动物实验中低剂量重复接触与大剂量一次性接触的年龄差别

1.6 OPI与眼毒性

1.6.1相关实验室研究

1.6.2临床病例发现

1.7本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1主要试验仪器

2.2药品和试剂

2.3动物及处理

2.4视网膜单细胞分离

2.5细胞凋亡分析

2.5.1形态学观察

2.5.2细胞凋亡的定量分析——异硫氰酸荧光素标记Annexin V(Annexin V-FITC)检测凋亡

2.6 MDA分析

2.7单细胞电泳(SCGE)

2.8各种抗氧化酶测定

2.8.1 SOD活性测定

2.8.2 CAT活性测定

2.8.3 GPX活性测定

2.9 AChE的测定

3.10蛋白含量测定

3.11激光共聚焦显微镜(LSCM)检测细胞内游离钙离子浓度

3.12统计分析

3结果

3.1 CPF可诱导小鼠的视网膜细胞凋亡

3.2 CPF可诱导小鼠视网膜细胞中的活质分子的损伤

3.3维生素C和E的联合保护作用

3.4维生素C和E的联合应用提高了AChE的活性

3.5维生素C和E的联合应用降低了小鼠视网膜细胞内游离钙的浓度

4 讨论

4.1 CPF确实有使眼睛致毒的作用

4.2高比例的多不饱和脂肪酸是视网膜易于氧化胁迫的组织学基础

4.3氧化胁迫加剧了CPF视网膜致毒

4.4 AChE抑制和[Ca2+]i上调参与了CPF视网膜致毒

4.5视网膜细胞内钙离子增加加剧了视网膜细胞的凋亡

4.6抗氧化剂维生素C和E对视网膜的保护作用

4.7结论

参考文献

在学期间研究成果

致谢