盐胁迫下青杨叶片蛋白质组的双向电泳体系构建与差异表达

摘要

土壤盐渍化是陆地生态系统中的重要胁迫生境类型之一，对陆地生态系统的植被分布和植物生理生化性状产生了显著影响。如何改良和利用盐碱化土地成为当前一个迫切需要解决的科学问题。提高植物的耐盐性是改良和利用盐渍化土壤的一个重要生物学措施。要选育高耐盐性的植物品种，必须深入研究植物的耐盐机理。传统的研究多集中在少数基因的转入和表达领域，难以揭示植物耐盐的综合机理。蛋白质是各项生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究可以直接阐明植物在盐胁迫条件下的变化机制。 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是研究蛋白质核心技术之一，但此法仍具有重复困难、样品上样量相对较少，低丰度蛋白质很容易被高丰度蛋白所掩盖、一些相对分子质量高或极酸、极碱的蛋白质无法分离等不足之处。杨树是开展分子生物学研究的模式植物之一，青杨(Populus cathayana)是杨属的典型物种。本文以青杨叶片为材料，研究盐胁迫生境条件下青杨叶片中蛋白质的表达差异，但鉴于其组织富含色素、多酚、多糖、有机酸等次生代谢物质，样品制备较难。因此，在进行盐胁迫青杨叶片蛋白质组的研究之前，必须首先构建和优化适合青杨叶片蛋白质的双向电泳体系；在此基础上，以正常条件下生长的青杨为对照，研究盐胁迫生境条件下青杨叶片中蛋白质的表达差异，期望有助于进一步阐明植物的耐盐机理，培育高耐盐性的新品种。本文主要结论如下： (1)通过单、双向的SDS-PAGE发现，用酚抽法得到的蛋白质条数要比改良丙酮沉淀法和TCA-丙酮沉淀法获得的条带数多，经ImageMaster 2D Platinum 6.0软件分析蛋白质点有721个，比TCAI丙酮沉淀法得到的蛋白质点数多118个，比改良丙酮沉淀法得到的蛋白质点数多284个，且蛋白质点呈圆形或椭圆形，比较均匀地分布在凝胶上。 (2)对于24cm，pH3-10的线性IPG胶条，上样量为100μg/IPG的胶条获得的蛋白质点数非常少，低丰度蛋白质点模糊不清；上样量达300μg/IPG的胶条，检测到的蛋白质点有600多个，均匀的分布在胶图上，所得胶图横向与纵向拖尾少；上样量达600μg/IPG的胶条上则产生明显的横向条纹。 (3)延长低电压聚胶时间，可以使电压最终达到8000V，很好的完成等电聚焦。聚焦时间为90000Vh时，蛋白质点清晰、均匀的分布于整个图谱上；聚焦时间为40000Vh时，大部分蛋白质还没有运动到自身的等电点，在胶图上表现为一些水平的线状；聚焦时间为150000Vh时，则出现阴极漂移现象。 (4)平衡时间为10min时，蛋白质点有拖尾现象；平衡时间为20min时，蛋白质点清晰可辨，均匀的分布于整个图谱上，是最佳的实验体系选择；平衡时间为30min时，则造成部分蛋白质点丢失。 因此，对24cm，pH3-10的线性IPG胶条，最佳的电泳体系是：采用酚抽法提取蛋白质，上样量为300μg/IPG的胶条，聚焦时间为90000Vh，平衡时间为20min。 (5)利用最佳的电泳体系进行盐胁迫处理与对照蛋白质点的比较，采用ImalzeMaster 2D Platinum 6.0软件对图谱进行分析发现，显著差异的点有46个，其中下调蛋白点有12个，上调蛋白点有34个，另有4个新出现的蛋白质点。推测这些差异表达蛋白与植物生理生化代谢、膜透性及膜稳定性等存在密切关系，从而使植物适应盐胁迫环境。

目录

声明

前言

第一章文献综述

1植物耐盐机理的研究进展

1.1离子平衡和区域化

1.2小分子渗透调节物质的合成和积累

1.3大分子蛋白类的积累

1.4其他

1.5杨树耐盐的研究进展

2植物蛋白质组的研究进展

2.1双向聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2质谱(Mass Spectrometry，MS)技术

2.3蛋白质组数据库(Protcome Database)

2.4植物环境胁迫蛋白质组研究进展

3本研究课题的提出

第二章青杨叶片蛋白质双向电泳技术体系的优化与构建

1材料与方法

1.1植物材料

1.2青杨叶片蛋白的提取

1.3蛋白质定量

1.4蛋白质上样量的比较

1.5不同的等电聚焦参数对等电聚焦电泳的影响

1.6平衡时间的优化

1.7凝胶染色

1.8凝胶图像的扫描和数据分析

2结果与分析

2.1蛋白质的定量检测

2.2制备样品方法的选择

2.3蛋白质上样量的比较

2.4不同的等电聚焦参数对等电聚焦电泳的影响

2.5平衡时间的优化

3讨论

3.1样品制备

3.2电泳条件

3.3蛋白质定量方法的选择

第三章盐胁迫条件下青杨叶片差异蛋白分析

1材料与方法

1.1植物材料与盐处理

1.2青杨叶片蛋白的提取

1.3第一向等电聚焦(IFF)

1.4IPG胶条的平衡

1.5第二向SDS-PAGE

1.6凝胶染色

1.7凝胶图像的扫描和数据分析

2结果与分析

2.1青杨叶片蛋白分离的重复性

2.2盐胁迫下青杨双向电泳图谱

2.3差异表达蛋白的分析

3讨论

3.1双向电泳重复性

3.2盐胁迫下蛋白质点的差异表达

第四章结论与展望

参考文献

硕士期间发表的学术论文与项目资助

致谢