Slit-Robo信号在口腔癌形成中的功能研究

摘要

背景与目的： Slit蛋白是一类已知的分泌型蛋白，它通过其受体Roundabout(Robo)作为神经轴突导向和神经元迁移的排斥性因子以及白细胞趋化的抑制因子发挥重要的作用。新近研究发现Slit-Robo信号可介导肿瘤细胞与内皮细胞间“对话”机制，从而参与了肿瘤的新生血管形成，这为抑制肿瘤生长提供了新的分子靶点。但有关该信号在肿瘤的发生发展中是否也介导了肿瘤细胞之间的“对话”，对肿瘤成癌过程中的血管形成、增殖、凋亡、转移等作用机制如何，靶向该信号是否能抑制肿瘤生长均未见报道。本研究拟全面探讨Slit-Robo信号在口腔癌发生和发展的作用及其机制，为口腔癌治疗提供了新的分子靶点。 方法： 本研究利用DMBA化学诱导的金黄地鼠颊囊癌自发成癌模型、选用了117例病人口腔癌成癌各阶段临床标本、高低转移的舌癌细胞系、鸡胚等实验材料，应用分子病理学、细胞生物学、分子生物学等研究方法，重点探讨了Slit-Robo信号系统在口腔癌和地鼠颊囊癌粘膜癌变过程中的作用及与新生血管形成的关系：同时采用Slit-Robo信号特异性阻断抗体R5作为干预手段，进行了靶向性抑制地鼠颊囊癌生长体内治疗；并研究了在R5抗体作用下对舌癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响。 结果： 1、Slit2蛋白在人颊部口腔粘膜正常组织和单纯增生组织中呈弱阳性表达；在异常增生及原位癌时表达增强；鳞状细胞癌时阳性率明显增加，强阳性的癌细胞呈巢状浸润。并发现在鳞癌组织中Slit2表达由表面到深层呈逐渐增强的梯度分布，癌细胞浸润的最前缘与正常粘膜临近的区域Slit2表达呈明显的强阳性。口腔粘膜癌变过程中Robol蛋白的表达比较弱且分布无明显特征。同时Slit2在口腔粘膜癌变过程中表达增强趋势与VEGF(血管内皮生长因子)表达趋势和MVD值(微血管密度)的增加均有明显的相关性。 2、Slit2蛋白在地鼠正常粘膜中表达很弱；在异常增生时开始增强；在原位癌时明显增强；到鳞状细胞癌是表达呈100％，染色强度也明显增强。Robol表达在成癌各阶段新生血管内皮细胞上，并与Slit2表达趋势有明显的相关性。Slit2在成癌中的表达增强趋势与VEGF和MVD也均有明显的相关性。 3、应用R5抗体腹腔注射干预地鼠颊囊癌生长，结果显示R5抗体组与C-AB和Blank组相比肿瘤体积明显缩小；HE染色可见肿瘤组织内新生血管数目明显减少；瘤体抑制率达66％；MVD计数和BrdU阳性细胞计数明显下降。而VEGF的表达、地鼠血液和肿瘤周边的白细胞计数，各组间均没有明显的差异。应用鸡胚绒毛尿囊膜血管抑制实验证实R5抗体作用也可使血管生成显著减少。 4、用免疫组化结果显示舌鳞状上皮癌脑转移亚系TB细胞均表达Slit2和Robo1蛋白；Western blot结果也显示TB细胞表达Robo1蛋白，而Slit2蛋白存在于TB细胞培养液中，说明Slit2蛋白属分泌型蛋白。应用R5抗体干预TB细胞，结果显示R5抗体组与C-AB组和Blank组相比TB细胞生长曲线、克隆形成率明显降低；细胞周期被阻滞在G2/M期；PCNA和Ki-67蛋白的表达均明显降低。用R5抗体诱导TB细胞凋亡，结果显示R5抗体组与C-Ab组和Blank组相比凋亡细胞明显增加、出现明显“亚二倍体”凋亡峰、出现典型的凋亡细胞、出现明显的DNA Ladder凋亡条带、Fas/FasL的表达明显增强。 5、用流式细胞术细胞内因子检测法显示舌鳞状上皮癌细胞系Tca8113和脑转移亚系TB中均有Slit2和Robo1蛋白表达，并且TB表达高于Tca8113细胞。应用R5干预TB和Tca8113细胞，结果显示R5抗体组与C-AB组相比TB及Tca8113细胞对FN的粘附率和迁移距离明显下降，对TB细胞的粘附抑制更为显著；对FN的侵袭能力也明显下降，但两种细胞无明显的差别；R5还可抑制两种细胞的基质金属蛋白酶（MMP2和MMP9)的活性，并且对MMP-2的活性抑制最为明显；同时Western-blot证实R5可明显上调TB中E-cadherin蛋白的表达水平。运用鸡胚心肌侵袭实验表明R5抗体可使TB和Tca8113细胞侵袭能力减弱。 结论： 1、本研究Slit-Robo号在口腔癌形成过程中由癌前向癌的恶性转化中发挥了重要的“开关”作用，是肿瘤发生发展中的一个早期分子事件；它的激活与浸润癌进展和深层侵袭密切相关。其机制可能是Slit2蛋白的分泌具有重要的吸引新生血管形成、促进肿瘤组织恶性增殖和深层侵袭的作用。Slit2蛋白可作为一个早期生物标记物的监测对口腔癌的早期诊断和新的治疗靶点具有重要意义。 2、表明应用针对Robol的阻断性抗体R5后能够明显抑制地鼠颊囊癌的新生血管形成进而抑制肿瘤的生长。R5抗体抑制新生血管形成的作用是不依赖于VEGF而独立发挥作用的。肿瘤时Slit2在体内并没有直接参与白细胞的迁移。 3、舌鳞状上皮癌细胞系和脑转移亚系TB细胞均表达Slit2和Robol蛋白，表明为Slit-Robo信号介导肿瘤细胞之间的“对话”，具有“自分泌”功能；并提示R5抗体阻断Slit-Robo信号后抑制了TB细胞的增殖能力和诱导凋亡发生；这种作用是通过下调TB细胞的PCNA和Ki-67蛋白表达水平和上调Fas/FasL信号途径而实现的。表明Slit-Robo信号可正向调控肿瘤的发生发展。 4、表明Slit-Robo信号的激活与肿瘤的侵袭、转移性能有关，该信号的激活能够促进舌癌细胞的黏附、迁移和侵袭力，这种作用是通过提高基质金属蛋白酶MMP2的活性以及降低E-cadherin分子信号而实现的。 本研究结果首次表明，在口腔癌成癌过程中特别是由癌前阶段向癌转化时Slit-Robo信号对新生血管形成的重要“开关”作用，因此该信号有望成为肿瘤早期诊断的分子标志。R5抗体在体内能抑制地鼠颊囊癌的新生血管形成，在体外能促进舌癌细胞增殖、迁移能力和诱导凋亡，这证明Slit-Robo信号在肿瘤生长和转移中的正向调控作用，也表明在临床口腔癌治疗中R5抗体有望成为靶向Slit-Robo信号的有效药物。

目录

论文说明：缩略语表

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摘要

第一章立题依据和研究思路

第二章Slit-Robo信号在口腔癌和地鼠颊囊癌血管形成中的作用研究

第三章靶向阻断Slit-Robo信号抑制地鼠颊囊癌血管生成的作用研究

第四章Slit-Robo信号对人口腔癌细胞增殖、凋亡的影响

第五章Slit-Robo信号对人口腔癌细胞侵袭和转移能力的影响

全文小结

第六章文献综述：Slit-Robo信号在肿瘤中的作用研究

在学期间的研究成果

致谢