光周期相关基因在大豆成花诱导与开花逆转中的表达

摘要

大豆是典型的短日植物，在光周期反应的早期研究中被当作模式植物。与水稻、玉米等短日植物相比，大豆的光周期反应更加敏感，品种间的差异更大，单个品种的适应性狭窄一直阻碍着大豆育种工作的开展。对于光周期反应敏感的晚熟大豆品种来说，短日照不仅是成花诱导的必要条件，而且影响开花、结荚和鼓粒。一旦光周期条件不适，这些品种的生殖生长就会延迟，共至可从生殖生长状态逆转到营养生长状态。对大豆光周期反应机制的研究将为培育广适应的大豆晶种奠定基础。本研究利用RACE技术克隆了四个大豆光周期反应的相关基因，并通过同源比对搜索到七个相关的光周期反应基因，利用本实验室长期以来建立的短日照(开花)、长日照(持续营养生长)、短日照一长日照(开花逆转)三位一体的实验系统，采用Real-lime PCR技术研究了这11个基因在大豆成花诱导与开花逆转中的表达，并比较了它们在光周期敏感性不同品种中的差异。为了进一步验证与大豆光周期相关的GmSOC1基因的功能，本研究建立了利用发根农杆菌介导的豆科植物百脉根高效快速的转化平台，并将该基因转入百脉根中验证了其功能。具体研究结果如下： 1.克隆了四个大豆光周期反应的相关基因GmCOL1、GmCOL2、GmCOL3以及GmSOC1，它们分别编码含311，365，310和211个氨基酸的蛋白。同源比对结果显示，GmCOL1，GmCOL2， GmCOL3与豆科植物苜蓿和豌豆的CO-like基因的同源性最高；GmSOC1与拟南芥AGL20的同源性最高，达到70％，是MADS-box基因家族的一员。 2.利用Real-Time PCR技术，通过对10个内标基因的系统分析，我们发现看家基因GmELF1B在大豆光周期反应中较为稳定，可用作大豆光周期相关基因表达研究的内标基因。 3.以GmELF1B为内标基因，对克隆的四个大豆光周期相关基因以及通过同源比对筛选到的七个光周期相关的基因在光周期敏感品种ZGDD成花诱导与开花逆转中的表达进行了研究，结果发现，这11个大豆光周期相关基因在其成花诱导过程中的不同光周期条件下均有表达，但是长短日条件下的表达量和表达规律有所不同。它们并非特异地被短日条件诱导，在特定的阶段，长日条件也可以诱导它们的表达。 4.所检测的光周期相关基因在光周期敏感性不同的大豆品种的SAM中也均有表达，所不同的是，在光周期钝感品种HH27中这些基因的表达峰值出现的时间普遍比在光周期敏感品种ZGDD中出现的时间早，分子生物学检测结果与HH27在短日条件下开花比ZGDD早的生理现象相符合，但是这些基因在ZGDD中的表达峰值却比HH27中高。 5.对于光周期敏感品种ZGDD而言，经一定日数短日诱导后进行长日照处理，可以产生花序逆转和花逆转，甚至整株逆转，植株回复到营养生长的状态。通过研究大豆开花相关基因在ZGDD开花逆转中的表达发现，拟南芥分生组织特异基因LFY和AP1的同源基因GmLFY-like和GmAP1-like在逆转条件下的表达介于短日诱导条件和长日抑制条件之间，说明GmLFY-like和GmAP1-like可能具有维持大豆分生组织特性的功能。而光周期上游基因GmGI-like和PEBP家族基因只在逆转早期与GmLFY-like和GmAP1-like的表达相似，说明它们可能住开花逆转的早期发挥作用。 6.与拟南芥中的基因相似，大豆的光周期相关基因也呈现24小时的日变化规律，GmGI-like在长短日条件下的表达与拟南芥在长日下的表达模式相近而与水稻不同；GmCO-like的日变化与水稻Hd1和拟南芥CO均不同，但其在短日条件下的日变化与拟南芥COL1和COL2在长日下的日变化规律相似；大豆PEBP家族基因在短日下的日变化又与水稻短日下的日变化相似，但长日下的日变化却不相同，说明光周期凋控大豆相关基因对日长的响应机制可能与长日双子叶植物拟南芥以及短日单子叶植物水稻均不同。 7.结合发根农杆菌介导的遗传转化的高效性与百脉根品种“Superroot”简单、快速的再生体系，本研究建立了一个快速、高效的转化平台用于豆科植物基因功能的研究。转基因百脉根植株可在两个半月内获得，分子生物学检测验证了转基因事件的发生。同时，利用双元转化载体pGFPGUSPlus对一些可能影响转化效率的因子进行优化，进而得到92％的高效转化频率。同时，将一个来源于小麦、编码Na+/H+逆向转运蛋白的耐盐基因TaNHX2转到百脉根中，并对其耐盐性进行鉴定，从而验证此系统作为基因功能研究平台的实用性。在此基础上，将大豆中克隆的GmSOC1基因转到了百脉根中使其过表达，导致了百脉根提前开花，从而验证了此基因促进开花的功能，同时也说明了此转化平台可以用于逆境生物学与发育生物学的研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表Abbreviation

声明

第一章 前言

第一部分 光周期调控植物开花的研究进展

1.高等植物调控开花的途径

2.光周期现象

3.光周期反应类型

4.光周期调摔开花的模型

5.拟南芥光周期调控开花的途径

6.CO在日长测定中的作用

7.开花调控的整合因子

8.开花信号的长距离运输

9.长短日植物光周期反应的区别

10.大豆光周期相关研究

第二部分　大豆遗传转化研究

1.大豆遗传转化的再生系统

2.大豆遗传转化方法及其研究进展

3.发根农杆菌及其Ri质粒的研究进展

4本研究的目的意义

第二章　大豆光周期反应相关基因的克隆与表达分析

1 大豆光周期反应相关基因的克隆

1.1材料与方法

1.2结果与分析

1.3讨论

2大豆开花相关基因的表达分析

2.1材料与方法

2.2结果与分析

3讨论

3.1内标基因在基因表达研究中的应用

3.2大豆光周期相关基因在不同大豆品种中的表达差异

3.3大豆光周期相关基因在自贡冬豆开花逆转中的作用

3.4大豆光周期反应相关基冈的昼夜节律

第三章　豆科植物基因功能验证平台的建立与大豆光周期调控开花相关基因的功能分析

1材料与方法

1.1豆科植物基因功能验证平台的建立

1.2豆科植物基因功能验证平台的检测

1.3 GmSOC1基因的功能分析

2结果与分析

2.1豆科植物基因功能验证平台的建立

2.2豆科植物基因功能验证平台的实用性检测

3讨论

参考文献

附录

在读期间研究成果

致 谢