抗草甘膦aroAM1基因转化烟草的研究

摘要

草甘膦是70年代开发的世界上最为成功的一种除草剂。由于具有广谱性，对环境无污染，对人和动物的健康几乎不影响，能除掉其他除草剂难以铲除的多种多年生植物等优点，这种除草剂被广泛使用。 近年来，抗草甘膦转基因作物的研究进展迅速。从1996年美国种植抗草甘膦转基因大豆开始，全球转基因作物的数量在逐年增加，然而这些品种几乎都是孟山都公司的专利，因此开发自主知识产权的、商业化的抗草甘膦作物，成为当前国内研究的重点。 5.烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)是草甘膦作用机理中的关键酶之一，它由aroA基因所编码。 本实验所用基因为沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)中aroA基因的重组基因aroAM1。 本实验通过农杆菌介导法[1]，用农杆菌感染受伤的烟草叶片细胞，使外源基因aroAM1转化到烟草基因组中。 最后，利用组织培养技术，再生出转基因烟草植株。 获得转aroAM1基因的农杆菌后，在优化的含有0.1μg/ml IAA，2μg/ml6-BA，500μg/ml CB，24μmol/L草甘膦的培养基上培养烟草叶片，获得再生烟草植株。 然后在三个不同水平上对再生烟草植株进行检测：在分子水平上，PCR检测阳性率为100％；在器官水平上，转基因的离体烟草叶片对草甘膦的抗性增加了12倍；在植株水平上，用5mmol/L草甘膦涂抹非转基因烟草和转基因烟草叶片，前者叶片枯黄，而后者变化不明显。 本实验结果表明在优化的草甘膦抗性培养基上筛选烟草，可获得有明显抗性效果的转基因烟草植株。 由于草甘膦的安全无污染等特点，以及本实验对aroAM1基因转入模式植物烟草中功能的验证，今后可深入的研究此基因在转基因植物的定位、目的蛋白EPSPS的表达以及草甘膦耐受机制等方面奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：常用缩写词

声明

第一章前言

1.1草甘膦简介

1.1.1草甘膦的理化性质

1.1.2草甘膦的作用特点

1.1.3草甘膦的作用机理

1.2获得抗草甘膦植物的方法

1.2.1促使EPSPS过量表达

1.2.2导入非敏感型的EPSPS

1.2.3转入降解草甘膦的基因

1.3 EPSPS及其编码基因aroA的研究进展

1.3.1 EPSPS的定位

1.3.2 EPSPS的结构

1.3.3运用基因改造获得有抗性的EPSPS

1.4转抗草甘膦基因的主要方法和原理

1.4.1农杆菌介导法

1.4.2花粉管介导法

1.4.3基因枪转化法

1.4.4其它转化方法

1.5抗草甘膦转基因作物研究进展

1.5.1世界上抗草甘膦转基因作物的研究进展

1.5.2我国抗草甘膦转基因植物的研究进展

1.6本研究的目的意义

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1供试材料

2.1.2工具酶及其它试剂

2.2实验方法

2.2.1制备含有目的基因的农杆菌

2.2.2获得转化的烟草

2.2.3转基因烟草的鉴定

2.2.4 EPSPS抗体的制备

第三章实验过程及结果

3.1获得含有aroAM1目的基因的农杆菌

3.1.1扩增质粒pAM1Bt的酶切鉴定

3.1.2菌落PCR的鉴定农杆菌LBA4404的转化

3.2获得转基因的烟草

3.2.1实验植物材料的获得

3.2.2草甘膦筛选浓度的确定

3.2.3侵染叶片再生的烟草植株

3.2.4获得烟草的PCR检测

3.3转基因烟草的检测

3.3.1转基因烟草植株离体叶片的抗性检测

3.3.2转基因烟草植株涂抹草甘膦的检测

3.4转基因烟草EPSPS抗体的制备

第四章实验讨论与结论

4.1讨论

4.2实验结论

附表1基本培养基

参考文献

致谢