FITC及Gd-DTPA标记的可活化穿膜肽在人肝内胆管上皮细胞中的作用研究

摘要

目的：通过利用可活化穿膜肽的特性将荧光标记物及磁共振对比剂带入人肝内胆管上皮细胞，借此研究肝内胆管上皮细胞在胆管病中的变化，探讨在肝胆管病中体外监测胆管上皮细胞变化及药物靶向定位的可行性，为临床上治疗胆管病以新的思路，提高胆管病的治疗效果。
　　方法：
　　一、穿膜肽的合成及标记：可活化穿膜肽（EEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRR-Ahx-k）由上海淘普生物科技有限公司利用用固相法化学合成，并在其N端分别标记FITC及Gd-DTPA。
　　二、荧光显微镜分析：培养正常人肝内胆管上皮细胞（human intrahepatic bile duct epithelial cells，hIBDEC），培养成功后分别用含有2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的LPS的培养液培养，培养24h后再将每组分别用25umol?L-1、50umol?L-1、100umol?L-1、150umol?L-1标记有FITC的ACPP(FITC-ACPP)孵育2h，观察上诉各组细胞及无ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h组与无LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h组内的荧光表达情况，选择出LPS的刺激浓度范围及最佳的FITC-ACPP作用浓度。
　　三、流式细胞仪检测：（1）分别用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC72h，再将其与100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h。（2）用含有5μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC，按24h、48h、72h时间梯度培养后，再将其与100 umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC72h，再将其与100umol?L-1的FITC-ACPP按照1h、2h、4h的时间梯度共孵育，采用流式细胞仪检测上诉各组细胞内的荧光强度值。
　　四、磁共振成像研究：（1）分别用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC72h，再将其与100umol?L-1的标记有Gd-DTPA的ACPP（Gd-DTPA-ACPP）共孵育2h。（2）用含有5μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC，按24h、48h、72h时间梯度培养后，再将其与100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml的LPS培养液培养hIBDEC72h，再将其与100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP按照1h、2h、4h的时间梯度共孵育，采用磁共振成像仪检测上诉各组细胞及空白细胞组、无LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h组细胞内的平均信号强度值。并采用视觉评价法分析各组细胞内的磁共振信号变化特征。
　　五、统计学分析：采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。所有实验结果以均数±标准差（Mean±SD）表示。组与组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
　　结果：
　　一、荧光显微镜检测见无ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h组及无LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h组细胞内均未见荧光反应,其余各组均可见荧光反应。同一FITC-ACPP浓度孵育及孵育时间、不同LPS刺激浓度的细胞相比，10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml组荧光肉眼观无明显差异。20μg/ml LPS刺激浓度下细胞不能贴壁，未到24h细胞碎裂死亡，15μg/ml LPS刺激浓度组虽未碎裂死亡，但仅有少量细胞存活，FITC-ACPP孵育后冲洗细胞爬片时细胞脱离载玻片，故20μg/ml与15μg/ml LPS刺激浓度组未能进行荧光显微镜拍照；同一LPS刺激浓度、不同FITC-ACPP浓度孵育的细胞相比，肉眼观25umol?L-1与50umol?L-1组较100umol?L-1与150umol?L-1弱、100umol?L-1与150umol?L-1组无明显差异，故选择100umol?L-1的FITC-ACPP为实验浓度。
　　二、流式细胞仪检测见：（1）在5μg/ml LPS刺激浓度刺激72h、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育的条件下，随着FITC-ACPP孵育时间的增加（1h、2h、4h），平均荧光强度值逐渐增加，并有统计学意义（P<0.05）。（2）在5μg/ml LPS刺激浓度刺激、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h的条件下，随着LPS刺激时间的增加（24h、48h、72h），平均荧光强度值逐渐增加，并有统计学意义（P<0.05）。（3）在不同浓度的LPS刺激72h、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h的条件下，随着LPS浓度的增加（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml），平均荧光强度值虽有不同，但无统计学意义（P>0.05）。
　　三、磁共振成像研究示：（1）在5μg/ml LPS刺激浓度刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育的条件下，随着Gd-DTPA-ACPP孵育时间的增加（1h、2h、4h），平均磁共振信号强度值逐渐增加，并有统计学意义（P<0.05），视觉评价法亦能发现随着Gd-DTPA-ACPP孵育时间的增加，各组细胞间的磁共振信号强度逐渐增强。（2）在5μg/ml LPS刺激浓度刺激、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h的条件下，随着LPS刺激时间的增加（24h、48h、72h），平均磁共振信号强度值逐渐增加，并有统计学意义（P<0.05），视觉评价法亦能发现随着Gd-DTPA-ACPP孵育时间的增加，各组细胞间的磁共振信号强度逐渐增强。（3）在不同浓度的LPS刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育2h的条件下，随着LPS浓度的增加（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml），平均磁共振信号强度值虽有不同，但无明显统计学意义（P>0.05），视觉评价法亦未能发现差异。上诉各组细胞内的磁共振信号强度值均较空白细胞组及无LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h组强，并有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：标记有FITC及Gd-DTPA的ACPP具有靶向及高效的穿膜活性，其穿膜效率具有时间依赖性，且与一定浓度下的LPS对hIBDEC的刺激时间有关，可用于病理状态下的hIBDEC显像。

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前言

1材料与方法

1．1 主要实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 普通光学显微镜拍照

2.2 倒置荧光显微镜摄像

2.3 流式细胞仪检测

2.4 磁共振成像研究

3 讨论

4 结论

参考文献

综述: 穿膜肽的发展及研究进展

致谢

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