青霉Penicillium sp. F63 CGMCC1669来源木聚糖酶的基因克隆、异源高效表达和性质研究

摘要

木聚糖是一种由β-1，4-木糖苷键连接形成并带有多种取代侧链的异质多聚糖。作为植物细胞壁半纤维素的主要成份，木聚糖是仅次于纤维素的自然界最为丰富的可再生自然资源。木聚糖的完全降解需要多种酶的协同作用，其中最重要的木聚糖降解酶是内切-β-1，4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)。木聚糖酶在造纸、饲料、食品、纺织、能源科学和环境保护等领域上都有着广泛的应用前景。据报道各种微生物如细菌和真菌等都能产生木聚糖酶。丝状真菌因其分泌表达、易于培养和高木聚糖酶生产能力而成为木聚糖酶的理想来源。截止目前，一些青霉来源的木聚糖酶基因已经得到克隆并实现了异源表达，尽管如此，真菌来源的木聚糖酶因生产成本较高使其应用受到限制。因此，开发具有良好性能且产量较高的木聚糖酶有很大的必要性。本文报道了青霉Penicillium sp.F63 CGMCC1669来源的两个木聚糖酶基因的克隆(xyn11F63和xyn10F63)、xyn11F63基因在毕赤酵母中的高效表达及重组木聚糖酶的性质研究。 本研究利用Mandels-Weber培养基以桦木木聚糖为诱导底物通过天然菌株发酵的方法验证了Penicillium sp.F63产木聚糖酶的能力。我们通过简并PCR、热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和反转录PCR(RT-PCR)克隆得到了两个木聚糖酶编码基因，分别为xyn11F63和xyn10F63。xyn11F63基因的染色体DNA长724 bp，内含一个73 bp的内含子，编码一个由217个氨基酸组成的第11家族木聚糖酶。Xyn10F63基因的染色体DNA全长1，338bp，含有4个长度分别为64、52、52和72bp的内含子和一个1098 bp的开放阅读框(编码一个第10家族的木聚糖酶)。根据基因xyn11F63推导出的氨基酸序列与青霉菌株40(Penicillium sp.strain40)米源的第11家族木聚糖酶序列一致性最高，达70％；xyn10F63编码的氨基酸序列与青霉Penicillium chrysogenum来源的第10家族木聚糖酶氨基酸序列一致性最高为81％，以上结果表明这两个木聚糖酶基因均为新基因。构建的重组表达载体pP1C9-xyn11F63转化毕赤巴斯德酵母GS115感受态细胞后，在甲醇的诱导下xyn11F63基因实现了功能性高效表达，诱导72 h后发酵上清液中的酶活力可达516 U/ml，是目前报道的最高水平。当重组木聚糖酶(rXYN11F63)纯化至电泳纯时，rXYN11F63在pH4.540℃条件下酶活力最高，且在酸性条件(pH4.5～9.0)下重组酶是稳定的。rXYN11F63对proteinaseK、trypsin、subtilisin A和α-chymotrypsin有良好的抵抗能力。以燕麦木聚糖为底物时，rxYN11F63的比活力、Km和Vmax分别为7，988 U mg-1、22.2 mg ml-1和15，105.7μmol.min-1.mg-1。另外，rXYN11F63具有良好的底物特异性，没有纤维素酶活性。因此重组木聚糖酶rXYN11F63在造纸、饲料和食品等领域有潜在的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1木聚糖酶研究进展

1.2立题依据与研究目的

第二章木聚糖酶基因的克隆

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1 Penicillum sp.F63产木聚糖酶能力验证

2.2.2 Penicillum sp.F63基因组DNA的提取

2.2.3木聚糖酶基因同源克隆简并引物的设计

2.2.4木聚糖酶基因片段的克隆

2.2.5木聚糖酶完整基因的克隆与分析

2.2.6 Penicillum sp.F63总RNA的提取

2.2.7 木聚糖酶基因cDNA的克隆

2.2.8木聚糖酶基因cDNA序列分析

2.3实验结果

2.3.1 Penicillum sp.F63产木聚糖酶能力验证

2.3.2 同源克隆简并引物的设计

2.3.3 木聚糖酶基因片段的克隆

2.3.4木聚糖酶完整基因的克隆与分析

2.3.5 木聚糖酶基因cDNA的克隆

2.3.6木聚糖酶基因序列的分析

2.4讨论与小结

第三章基因xyn11F63在毕赤酵母中的表达与重组酶纯化

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1 重组载体pPIC9-xyn11F62的构建

3.2.2重组载体电击转化毕赤酵母

3.2.3木聚糖酶活力的测定

3.2.4木聚糖酶基冈在毕赤酵母中的表达

3.2.5 rXYN11F63的纯化与鉴定

3.3结果与分析

3.3.1 重组载体的构建

3.3.2线性化重组载体电击转化毕赤酵母

3.3.3 木聚糖酶活性测定中木糖标准曲线的绘制

3.3.4木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

3.3.5 目的蛋白rXYN11F63的纯化与鉴定

3.4讨论与小结

第四章重组木聚糖酶酶学性质研究

4.1材料

4.2实验方法

4.2.1 最适pH与pH稳定性

4.2.2最适温度与热稳定性

4.2.3不同金属离子及相关化学试剂对酶活的影响

4.2.4蛋白酶抗性

4.2.5木聚糖酶比活的测定

4.2.6底物特异性及动力学常数的测定

4.2.7燕麦与桦木木聚糖酶解产物分析

4.3结果与分析

4.3.1 最适pH

4.3.2 pH稳定性

4.3.3最适反应温度

4.3.4热稳定性

4.3.5不同金属离子和化学试剂对酶活力的影响

4.3.6蛋白酶抵抗能力

4.3.7比活力的测定

4.3.8底物特异性与催化反应动力学常数

4.3.9木聚糖酶解产物分析

4.4讨论与小结

第五章全文结论

第六章参考文献

硕士在读期间发表论文

致谢