碱性磷酸酶结构与活性的研究及DNA化学酶、MoFeco的模拟合成

摘要

生命体的一切物质变化和能量变化都是在酶的作用下进行的，因此酶学研究对于认识生命活动的本质和规律无疑是十分重要的。本论文介绍了酶学研究的进展，酶的催化机制、研究方法和分子酶学、功能酶学及应用酶学的研究现状。综述了碱性磷酸酶、限制性内切酶、固氮酶等的结构功能、研究概况及发展前景，提出了本论文的选题目的和意义。
　　 通过ICP、荧光光谱研究了不同pH值及不同浓度时，Co2+离子对牛小肠碱性磷酸酶(calf intestine alkaline phosphatsae，CIP)活性中心Zn2+和Mg2+离子的取代作用。实验发现，随着Co2+离子浓度的增加，CIP活性中心的Zn2+离子含量逐渐降低，直至被完全取代；Mg2+离子含量呈现先降低后又升高；以及随pH值升高，对Zn2+和Mg2+离子的取代作用增强等现象。通过CD光谱研究了氯化钴取代CIP活性中心金属离子对CIP二级结构的影响，首次得到了不同取代条件下CIP平均二级结构含量。采用紫外光谱研究不同条件下CIP的活性发现，随着Zn2+离子逐渐被取代，CIP的酶活性也逐渐降低。证实CIP的酶催化作用主要由Zn2+离子承担，Mg2+离子则对CIP二级结构的稳定性有着重要作用。
　　 通过荧光光谱、CD光谱以及紫外可见光谱等研究了盐酸胍失活CIP肽链的再折叠及活性恢复的动力学过程，观察了不同La3+离子浓度对再折叠以及活性恢复动力学过程的影响。实验显示，在pH为8.0条件下，CIP肽链可以再折叠，同时有60-70％活性可以恢复。通过再折叠动力学常数以及活性恢复常数的计算表明，随着La3+离子浓度的增加，二级结构的恢复及CIP酶活性的恢复都出现逐渐加快的现象，表明失活CIP再折叠过程与活性恢复过程具有一致性。为研究蛋白质结构与功能关系提供一定的理论依据。
　　 采用分子自组装方法，合成了三种三元混合配体的配合物，单晶测定表明其化学组成分别为：[Mn(N-methyl-imidazole)2(μ1,3-N3)2]，[Cu(DMAP)2(SCN)2(DMF)2]和[Cu(DMAP)2(SCN)2]。通过紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、粘度分析和循环伏安等方法，研究了生理条件下，配合物与DNA的相互作用和对PBR322质粒体DNA的切割作用。结果表明，锰配合物与DNA以沟面模式结合，对PBR322质粒体DNA有一定的切割作用；铜配合物均与DNA以插入模式结合，对PBR322质粒体DNA有较好的切割作用。
　　 2002年获得分辨率为1.16A固氮酶活性中心MoFe-coX射线晶体衍射图，其电子密度图显示MoFe-co中心存在一个P区元素，该元素可能是C、N、O或者B。根据这一实验结果，本文开展了中心原子为N的铁钼辅基(FeMo-co)的模拟合成研究，已合成了一系列的Fe-μ-N-(CO)x、Fe-μ-N-(CO)x-S簇Cp-Mo-(CO)x、Cp-Mo-(CO)x-S簇化合物，为进一步模拟合成FeMo-co奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写列表

声明

第一章绪论

1.1酶学及其研究发展历史

1.2酶催化原理

1.3酶分析方法

1.4酶学研究进展

1.5碱性磷酸酶(AP)

1.6限制性内切酶以及具有核酸活性的配合物对DNA的切割作用

1.7固氮酶

1.8本论文的选题目的和意义

1.9参考文献

第二章Co2+离子对CIP二级结构及活性的影响

2.1摘要

2.2前言

2.3实验部分

2.3.1试剂与材料

2.3.2蛋白质浓度的测定

2.3.3 CIP活性分析

2.3.4仪器

2.3.5实验方法

2.4结果与讨论

2.4.1 Co2+取代CIP活性中心金属离子

2.4.2 CIP二级结构的研究

2.4.3 CIP活性的变化

2.5本章小结

2.6参考文献

第三章La3+离子对盐酸胍失活CIP再折叠以及活性恢复动力学过程的影响

3.1摘要

3.2前言

3.3实验部分

3.4结果与讨论

3.4.1失活CIP的CD光谱以及活性的变化

3.4.2不同La3+浓度对CIP再折叠过程的影响

3.4.3不同La3+浓度对CIP活性恢复的影响

3.4.4结论

3.5本章小结

3.6参考文献

附图

第四章具有化学核酸酶活性的锰、铜配合物与DNA的相互作用及对DNA切割作用的研究

4.1摘要

4.2前言

4.3实验部分

4.4.结果与讨论

4.4.1锰配合物的结构分析

4.4.2铜配合物(1)、(2)的结构分析

4.4.3配合物与DNA相互作用的研究

4.5切割pBR322DNA的研究

4.5.1锰配合物(1)对DNA的切割作用

4.5.2铜配合物(1)对DNA的切割作用

4.6本章小结

4.7参考文献

第五章固氮酶活性中心MoFe-eonfector的模拟合成

5.1摘要

5.2前言

5.3实验部分

5.3.1试剂

5.3.2仪器

5.3.3 Fe-μ-N-(Co)x-S簇化合物的合成

5.3.4 Cp-Mo-(CO)x-S簇化合物的合成

5.3.5模拟合成FeMoco的模型化合物的初步研究

5.4结果与讨论

5.4.1 Fe-μ-N-(CO)x-S簇化合物的表征

5.4.2 Cp-Mo-(CO)x-S簇化合物的表征

5.5参考文献

附图

博士期间发表及接收文章情况

致谢