丹参酚酸A对脑缺血后Wnt/β-catenin信号通路的影响

摘要

目的：通过研究丹参酚酸A对脑缺血后Wnt/β-catenin信号通路的影响，探讨丹参酚酸A对脑缺血神经保护作用的潜在机制。
　　方法：体内实验：研究丹参酚酸A对脑缺血后细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响。54只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组，每组18只。采用线栓法制作永久性大脑中动脉闭塞模型。丹参酚酸A组于造模后0 h及造模后6 h，舌静脉注射丹参酚酸A，其余各组注射等体积生理盐水。造模后24h时按 Bederson评分标准行神经功能评分，采用2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色检测脑梗死体积。HE染色检测缺血侧皮质区形态学改变，TUNEL原位标记法检测缺血侧皮质区细胞凋亡，免疫组化及蛋白质印迹法检测缺血侧皮质区Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表达。
　　体外实验：进一步明确丹参酚酸A可通过激活Wnt/β-catenin信号通路而减轻脑缺血损伤。成年雄性Sprague-Dawley大鼠，共制作海马脑片36片，每组9片。海马脑片随机分为空白对照组、氧糖剥夺组、丹参酚酸A组和丹参酚酸A+Wnt/β-catenin通路特异性抑制剂 XAV-939组。缺氧缺糖人工脑脊液模拟脑缺血损伤环境，双极电极刺激CA3区Schaffer侧枝，玻璃电极接收CA1区辐射层海马诱发电位信号，BL-420F生物机能实验系统测出兴奋性突触后电位的斜率（ slope excitatory postsynaptic potentials,S-EPSP）。
　　结果：体内实验：（1）神经功能缺损评分：假手术组、脑缺血组、丹参酚酸A组Bederson评分分别为（0.000±0.000）、（3.722±1.018）、（2.444±0.705），三组间Bederson评分差异有统计学意义（F=52.482, P<0.05）。与假手术组相比，脑缺血组Bederson评分显著增高（P<0.05）；与脑缺血组相比，丹参酚酸A组Bederson评分显著降低（P<0.05）。（2）脑梗死体积检测：假手术组、脑缺血组、丹参酚酸A组脑梗死体积分别为（0.000±0.000mm3）、（212.702±8.029mm3）、（79.038±10.665mm3），三组间脑梗死体积差异有统计学意义（F=1459.000, P<0.05）。与假手术组相比，脑缺血组脑梗死体积显著增加（P<0.05）；与脑缺血组相比，丹参酚酸A组脑梗死体积显著减少（P<0.05）。（3）HE染色：假手术组神经细胞形态无异常，胞膜、核膜清晰，核仁明显；脑缺血组大量神经细胞形态异常，胞体皱缩成三角形，胞浆嗜伊红深染，核固缩或溶解；丹参酚酸A组少量神经细胞形态异常，胞体皱缩成三角形，胞浆嗜伊红深染，核固缩或溶解。与假手术组相比，脑缺血组呈中重度缺血改变；与脑缺血组相比，丹参酚酸A组呈轻中度缺血改变。（4）神经细胞凋亡检测：假手术组、脑缺血组、丹参酚酸A组神经细胞凋亡数分别为（2.000±1.414）、（30.333±2.251）、（18.833±2.041）,三组间神经细胞凋亡差异有统计学意义（F=325.386, P<0.05）。与假手术组相比，脑缺血组神经细胞凋亡数显著增加（P<0.05）；与脑缺血组相比，丹参酚酸A组神经细胞凋亡数显著减少（P<0.05）。（5）免疫组织化学方法检测Wnt3a、p-GSK-3β及β-catenin表达：① Wnt3a表达：假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组的Wnt3a的表达分别为（0.194±0.011）、（0.155±0.008）、(0.163±0.002)，3组间存在显著性差异（F=21.054，P<0.05)。与假手术组相比，脑缺血组Wnt3a表达显著降低（P<0.05）；与脑缺血组相比，丹参酚酸A组Wnt3a表达显著增高（P<0.05）。② p-GSK-3β表达：假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组的p-GSK-3β的表达分别为（0.143±0.005）、（0.188±0.004）、（0.162±0.012），3组间存在显著性差异（F=41.318, P<0.05)。与假手术组相比，脑缺血组p-GSK-3β表达显著增高（P<0.05）；与脑缺血组相比，丹参酚酸A组p-GSK-3β表达显著降低（P<0.05）。③β-catenin表达：假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组的β-catenin的表达分别为（0.249±0.018）、（0.144±0.013）、（0.194±0.043），3组间亦存在显著性差异（F=56.587, P<0.05)。与假手术组相比，脑缺血组β-catenin表达显著降低（P<0.05）；与脑缺血组相比较，丹参酚酸A组的β-catenin表达显著增高（P<0.05）。（6）蛋白质印迹定量Wnt3a、p-GSK-3β及β-catenin表达：① Wnt3a：假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组Wnt3a表达水平分别为（1.000±0.190）、（0.800±0.185）、（1.198±0.262），3组间存在显著性差异（F=9.621, P<0.05）。与假手术组相比，脑缺血组Wnt3a表达显著降低（P<0.05）；与脑缺血组相比较，丹参酚酸A组的Wnt3a表达显著增高（P<0.05）。② p-GSK-3β：假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组p-GSK-3β表达水平分别为（0.650±0.150）、(1.290±0.250)、(1.190±0.250)，3组间存在显著性差异（F=19.668, P<0.05）。与假手术组相比，脑缺血组p-GSK-3β表达显著增高（P<0.05）；与脑缺血组相比较，丹参酚酸A组的p-GSK-3β表达显著降低（P<0.05）。③β-catenin：假手术组、脑缺血组和丹参酚酸A组β-catenin表达水平分别为(1.200±0.210)、(0.500±0.120)、(1.100±0.220)，3组间存在显著性差异（F=33.385, P<0.05）。与假手术组相比，脑缺血组β-catenin显著降低（P<0.05）；与脑缺血组相比较，丹参酚酸A组的β-catenin表达显著增高（P<0.05）。
　　体外实验：空白对照组、氧糖剥夺组、丹参酚酸 A组及丹参酚酸 A+ XAV-939组的S-EPSP变化分别为（100.00±0.00％）、（51.25±13.68%）、（89.50±7.46%）、（62.65±5.22%），4组间存在显著性差异（F=57.383, P<0.05）。与空白对照组相比，氧糖剥夺组S-EPSP变化显著降低（P<0.05）；与氧糖剥夺组相比，丹参酚酸A组S-EPSP变化显著增高（P<0.05）；与丹参酚酸A组相比较，丹参酚酸A组+XAV-939的S-EPSP变化显著降低（P<0.05）。
　　结论：（1）进一步证实丹参酚酸A对脑缺血损伤具有保护作用。
　　（2）丹参酚酸A可减轻脑缺血后神经细胞凋亡。
　　（3）丹参酚酸A可通过激活 Wnt/β-catenin信号通路而发挥脑保护作用。

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前言

1 材料

1.1 主要实验材料

1.2 主要实验试剂

2 方法

2.1 模型建立

2.2 症状和评分

2.3 模型给药方式

2.4 TTC染色测量脑梗死体积步骤

2.5 组织学标本制备步骤

2.6 HE染色步骤

2.7 TUNEL原位标记法检测凋亡神经细胞步骤：

2.8 Wnt3a、p-GSK-3β及β-catenin免疫组化染色步骤

2.9 免疫蛋白印迹定量Wnt3a、p-GSK-3β、β-catenin步骤

2.10 离体海马脑片检测兴奋性突触后电位斜率（S-EPSP）步骤

2.11 统计学方法

2.12 实验流程示意图

3 结果

3.1 MCAO模型建立

3.2 Bederson神经功能评分

3.3 TTC染色及脑梗死体积检测

3.4 HE染色光镜下组织学观察

3.5 光镜下凋亡神经细胞计数

3.6 免疫组织化学染色及目标蛋白平均光密度值(OD值)

3.7 免疫蛋白印迹定量目标蛋白

3.8 兴奋性突触后电位斜率（S-EPSP）变化

4 讨论

4.1 动物模型及脑片模型

4.2 丹参酚酸A对脑缺血损伤的保护作用

4.3 丹参酚酸A可激活Wnt/GSK-3β/β-catenin通路保护脑缺血损伤

5 结论

参考文献

综述: Wnt/β-catenin信号转导通路与脑缺血后细胞凋亡

致谢

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