活动性结核病特异性生物标志物的筛选及Rv3480c的克隆、表达与纯化

摘要

目的：利用蛋白芯片技术筛选活动性结核病的特异性生物标志物，并将目的蛋白进一步克隆表达和纯化。
　　方法：用正常对照组、结核分枝杆菌潜伏感染组、活动性结核组病人血清与固定在芯片上的结核分枝杆菌菌体蛋白结合，再用抗人IgM荧光标记二抗（cy5标记，呈现红色）和抗人IgG荧光二抗（cy3标记，呈现绿色）检测，通过荧光扫描仪读取信号，根据信号的强弱筛选特异性蛋白质。用primer5.0软件设计合成Rv3480c引物，PCR扩增Rv3480c全基因，构建Rv3480c-pET28a融合基因，提取质粒DNA，双酶切及测序分析验证质粒DNA，将重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21（DE3）菌体内，不同浓度IPTG诱导蛋白质表达，考马斯亮蓝染色及Western blot验证Rv3480c的表达，并通过反复低温冻融、不同浓度尿素复性的方法进行包涵体中蛋白质的纯化。
　　结果：通过蛋白芯片技术最终筛选出15个与活动结核病诊断相关的特异性结核分枝杆菌蛋白，包括Rv3480c IgM、Rv1860 IgG、Rv2352c IgM、Rv1597 IgM、Rv2688c IgM、Rv0049 IgM、MT1560 IgG、Rv2511 IgG、Rv0350 IgM、Rv0350 IgG、Rv0270 IgM、Rv1876 IgM、Rv0494 IgM、Rv2031c IgG、Rv2450c IgM（已申请国家发明专利，申请号：201610089179.1）。将荧光信号最强所对应的蛋白按照不同的组合，制成芯片，用正常对照组、结核分枝杆菌潜伏感染组、活动性结核组病人血清检测该组合芯片，结果显示其诊断活动性结核病的特异性为90.3％，灵敏度为85.4%。筛选出的15个蛋白中，结核分枝杆菌蛋白Rv3480c在抗原抗体结合反应中反应较强，可作为活动性结核病的特异性生物标志物之一。进一步成功构建Rv3480c-pET28a融合质粒。0.2 mM IPTG在16℃条件下诱导蛋白质的表达，Western blot结果证明成功表达结核分枝杆菌Rv3480c蛋白质。考马斯亮染色示Rv3840c蛋白表达于包涵体中，经4M尿素溶解包涵体，分别用2M、1M尿素及1xPBS透析后，成功纯化活动性结核病生物标志物Rv3480c蛋白质。
　　结论：使用蛋白芯片技术通过两次芯片与血清反应，成功筛选出15个与活动结核病诊断相关的特异性结核分枝杆菌蛋白，这些蛋白组合对于区分活动结核病、潜伏感染、正常人群有较好的特异性（90.3%）和敏感性（85.4%）。我们通过基因克隆技术成功获得Rv3480c重组蛋白，为其结构和功能的研究、新型抗结核药物的研制以及结核病的血清学诊断奠定了基础。在构建大肠杆菌重组表达载体体系及蛋白的表达、包涵体的纯化过程中，我们对部分反应条件进行优化，为更好的进行包涵体蛋白纯化提供了思路。

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中英文缩略词表

前言

材料与方法

1. 主要实验材料

2. 主要试剂名称

3. 主要试剂配制

4. 主要实验仪器

5. 实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:结核病血清学诊断研究进展

致谢

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