利用体细胞突变方法鉴定胆固醇代谢调控基因

摘要

胆固醇是哺乳动物体内最重要的一类甾醇小分子。如果其代谢异常会导致许多疾病的发生，如体内胆固醇水平过高可引起动脉粥样硬化并进而引发中风以及冠心病等；另外，胆固醇代谢失调也与老年痴呆症、肥胖、糖尿病等存在密切关系。生理条件下胆固醇的合成被一套严格且精巧的调控机制所调控，其最主要的反馈调控途径有两条。第一条是对胆固醇内源合成途径中的限速酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA Reductase，简称HMGCR)的调控；另外一条是转录因子SREBP剪接的调控途径。
　　 为了进一步阐明胆固醇内源合成途径调控的分子机制，我们以基于慢病毒的VBIM(Validation-BasedInsertionalMutagenesis)插入突变系统作为诱变工具，结合体细胞遗传学来寻找胆固醇合成途径中新的调控因子。我们的研究结果表明，通过新的诱变方法，筛选得到了多种胆固醇合成调控异常的突变细胞株；鉴定出一些新型突变体；还得到一些可能是未知基因的克隆，目前这些突变体正在鉴定过程中。

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声明

前言

1.心脑血管疾病、肥胖等慢性疾病严重威胁人类健康

2.胆固醇的分子结构和生理功能

3.胆固醇代谢及其相关疾病

4.胆固醇的生物合成及其负反馈调控机制

5.胆固醇代谢调控研究中的体细胞遗传学

6.正向遗传学与新基因的发现

7.病毒诱变系统

8.本论文的创新之处和研究意义

实验材料和方法

1.实验材料

1.1.试剂

1.2.细胞系和培养基

1.3.菌株和质粒

1.4.引物序列

1.5.抗体

2.实验方法

2.1.常规的分子生物学技术

2.2.病毒的包装和感染

2.3.结晶紫和油红O染色

2.4.细胞全蛋白的抽提

2.5.细胞RNA抽提

2.6.RT-PCR

2.7.实时定量PCR

2.8.iPCR

2.9. 3'RACE

实验结果

1.SREBP途径中相关调控因子

1.1. 25-HC对2C5细胞的毒性能被外源递送的胆固醇所克服

1.2.CHO-7细胞对SR-12813的敏感性严格依赖胞内胆固醇含量

1.3.截短型SREBP-2的突变体

1.4.SREBP-2过表达的突变

1.5.SCAP过表达的突变体

1.6.甾醇耐受的第三类突变体-Insig-1缺失的隐性突变

2.HMGCR途径中的调控因子

3.其他途径的调控因子

讨论

1.基于2C5(CHO-7/Insig-1)细胞以25-HC作为压力的筛选

2.基于HeLa细胞以SR-12813作为压力的筛选

3.基于CHO-7细胞以SR-12813作为压力的筛选

结论

参考文献

附录

致谢