朱砂与氯化汞、甲基汞吸收机制比较研究

摘要

目的：探索朱砂与氯化汞、甲基汞小肠吸收的机制。
　　方法：⑴建立UPLC-ICP/MS的分析方法，用于检测样本中无机汞和甲基汞的含量。⑵制备完整的Caco-2细胞模型，模型成功后，给予可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂与细胞孵育，通过MTT法检测细胞存活率及利用UPLC-ICP/MS检测AP侧、BL侧和细胞样本中的汞含量。⑶氢离子浓度对氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂吸收的影响，将实验分为空白组、对照组（pH7.4）和氢离子高浓度组（pH5.5），在AP侧，空白组给予含10％胎牛血清的培养基100μL，对照组分别给予用DMEM(含10% FBS)配制可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂100μL，氢离子高浓度组分别给予用 MES-DMEM(含10% FBS)配制可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂100μL，BL侧均给予DMEM(含10% FBS)600μL，与细胞孵育24 h后，取出AP侧、BL侧及细胞样本，采用UPLC-ICP/MS检测其汞含量。⑷钠离子对氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂吸收的影响，将实验分为空白组、对照组和无钠离子组，在AP侧，空白组给予含10%胎牛血清的培养基100μL，对照组分别给予用DMEM(含10% FBS)配制可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂100μL，无钠离子组分别给予用无钠离子试液配制可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂100μL，BL侧均给予DMEM(含10%FBS)600μL，与细胞孵育24 h后，取出AP侧、BL侧及细胞样本，采用UPLC-ICP/MS检测其汞含量。⑸ATP对氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂吸收的影响，将实验分为空白组、对照组和ATP抑制剂组，在AP侧，空白组给予含10%胎牛血清的培养基100μL，对照组分别给予用DMEM(含10% FBS)配制可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂100μL，ATP抑制剂组分别给予用ATP代谢抑制液配制可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂100μL，BL侧均给予DMEM(含10%FBS)600μL，与细胞孵育24 h后，取出AP侧、BL侧及细胞样本，采用UPLC-ICP/MS检测其汞含量。⑹分别给予可溶性汞等摩尔浓度（0.1μmol/L）的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂100μL与细胞孵育24 h，取出细胞样本，用Real-Time PCR法检测CTL1、CTL2、PEPT1、PEPT2、MCT1、LAT1、LAT2、CNT1、CNT2、SGLT6、P-gp、BCRP、MRP3 mRNA基因的表达。
　　结果：①0.01g硫化汞的饱和溶液中汞含量有3.6×10-10g，占称取量的千万分之四；0.01 g朱砂的饱和溶液中汞含量为3.45×10-10g，占称取量的千万分之三点八；硫化汞和朱砂饱和溶液中均含有无机汞和甲基汞，其中硫化汞中甲基汞占硫化汞饱和溶液中总汞的13%，朱砂中甲基汞占朱砂饱和溶液中总汞的21.5%。②通过MTT实验证明在汞等摩尔浓度下氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂中细胞存活率均高于90%。③利用UPLC-ICP/MS检测给予用DMEM(含10% FBS)配制可溶性汞等摩尔浓度的氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂中BL侧样本中的汞含量显示，在BL侧，氯化汞、硫化汞和朱砂中无机汞分别占给药量的14.08%、0.94%和0.524%；甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞分别占给药量的38.5%、2.36%和4.4%，硫化汞组和朱砂组中总汞含量为氯化汞组汞含量的34.97%，是甲基汞组的12.79%。即硫化汞和朱砂进入BL侧的汞含量低于氯化汞和甲基汞。④氢离子高浓度组与对照组相比，在AP侧，氯化汞组无机汞含量下降8%，硫化汞和朱砂中无机汞含量均无明显变化。甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞含量分别下降39.7%、40.28%和30.8%；在细胞内，氯化汞组无机汞含量升高26.8%，硫化汞和朱砂中无机汞含量均无明显变化，甲基汞组甲基汞含量升高45.6%，硫化汞和朱砂中甲基汞含量分别升高126%、88.7%；在BL侧，氯化汞、硫化汞和朱砂中无机汞含量均无明显变化，甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞含量分别升高35.5%、61.14%、104%。即增大给药侧氢离子浓度时，促进氯化汞、甲基汞及硫化汞和朱砂中甲基汞的吸收。⑤无钠离子组和对照组相比，在 AP侧，氯化汞组中无机汞含量下降18.8%，硫化汞和朱砂中无机汞含量均无明显变化，甲基汞组甲基汞含量升高14.7%，硫化汞和朱砂中甲基汞含量分别升高28.8%和51.5%；在细胞中，氯化汞组中无机汞含量升高32.8%，硫化汞和朱砂中无机汞含量分别升高63.2%和66%，甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞含量均无明显差异；在BL侧，氯化汞、硫化汞和朱砂中无机汞含量无明显差异，甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞含量分别下降16.4%、35.3%和40.3%。即减少给药侧钠离子浓度时，促进了氯化汞及硫化汞和朱砂中无机汞的吸收，而抑制甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞的吸收。⑥ATP抑制剂组和对照组相比，在AP侧，氯化汞组无机汞含量升高14.29%，硫化汞和朱砂中无机汞含量均明显差异，甲基汞组中甲基汞含量增加50.7%，硫化汞和朱砂中甲基汞含量分别增加40.7%和39.7%；在细胞中，氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂汞含量均无明显差异；在BL侧，氯化汞、硫化汞和朱砂中无机汞含量均无明显差异，甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞含量分别下降71%、57.4%和71%。即当细胞内ATP受到抑制的情况下，抑制氯化汞、甲基汞及硫化汞和朱砂中甲基汞的吸收。⑦与空白组相比，硫化汞组和朱砂组中氢离子依赖性转运体PEPT1 mRNA表达显著降低（P<0.05）；氯化汞组和甲基汞组中钠离子依赖性转运体LAT1 mRNA表达显著升高（P<0.05）；氯化汞组和甲基汞组中ATP依赖性转运体MRP3mRNA表达显著升高（P<0.05）。
　　结论：氢离子浓度、钠离子浓度和ATP影响甲基汞、硫化汞和朱砂中甲基汞的吸收，而钠离子浓度对氯化汞、硫化汞和朱砂中无机汞的吸收有显著性影响；基于Caco-2细胞模型，在基底侧，硫化汞和朱砂吸收量远低于氯化汞和甲基汞的吸收量，可能与硫化汞和朱砂降低PEPT1mRNA表达，氯化汞和甲基汞升高LAT1mRNA和MRP3mRNA的表达有关。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要仪器设备

1.3 实验方法

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 模型建立

2.2 硫化汞和朱砂饱和溶液中汞成分及含量分析

2.3 细胞存活率实验

2.4 氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂在Caco-2细胞模型中的转运

2.5 氢离子对氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂吸收转运的影响

2.6 钠离子对氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂吸收转运的影响

2.7 ATP对氯化汞、甲基汞、硫化汞和朱砂吸收转运的影响

2.8 氯化汞、甲基汞、硫化汞及朱砂对 PEPT1、LAT1、MRP3 等mRNA表达的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:含汞物质中汞的形态分析研究进展

致谢

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