淫羊藿苷对炎症细胞迁移粘附和血管重构的影响及机制研究

摘要

本文分析了淫羊藿苷对炎症细胞迁移粘附和血管重构的影响。本研究分为两个部分：
　　第一部分：淫羊藿苷改善野百合碱诱导的肺动脉高压模型小鼠血管重构。
　　目的：观察淫羊藿苷（Icariin，ICA）对野百合碱（MCT）所致的CX3CL1-/-小鼠及野生型小鼠肺动脉高压（PAH）模型的血管重构的影响，分析ICA抗PAH效应与CX3CL1的关系。
　　方法：雄性野生型和CX3CL1-/-小鼠各28只，均随机分为空白对照组、模型组、ICA组（60 mg/kg）、ICA组（120 mg/kg）。所有小鼠适应性饲养一周后，除空白组外均经颈背部一次性皮下注射MCT（70 mg/kg）建立PAH模型，造模后第7天按分组灌胃给药，空白对照组及模型组给予等量双蒸水，每天一次，连续21 d。给药21 d后采用B超检测PAH模型小鼠的左室短轴缩短率（FS）、心脏射血分数（EF）、舒张末期的右室内径（RVID;d）、左室质量（LV Mass）、左室舒张末期容积（LV Vol;d）、左室收缩末期容积（LV Vol;s）、每搏输出量（Stroke Volume）；记录小鼠的死亡率；HE染色观察肺小动脉病理学变化；测定右室重量、左室+室间隔重量并计算右心室肥大指数（RVHI=RV/LV+S）；免疫荧光法观察肺小动脉炎症细胞侵润情况。
　　结果：CX3CL1-/-小鼠：与空白对照组比较，模型组中FS、EF、Stroke Volume下降（P<0.05或P<0.01），RVID;d、LV Mass、LV Vol;s显著升高（P<0.05或P<0.01）， LV Vol;d无明显变化；RVHI增大（P<0.05）；死亡率为12.5％；肺小动脉管壁增厚，管腔狭窄，炎症细胞侵润。与模型组比较， ICA给药组FS、EF明显升高（P<0.01），RVID;d、LV Mass、LV Vol;s显著下降（P<0.05或P<0.01），LV Vol;d、Stroke Volume无明显变化；RVHI无差异；ICA组（60 mg/kg）死亡率为12.5%、ICA组（120 mg/kg）无死亡；肺小动脉管壁增厚减轻，炎症细胞侵润减少。野生型小鼠：与空白对照组比较，模型组中FS、EF显著下降（P<0.01）， RVID;d、LV Mass、LV Vol;d、LV Vol;s、Stroke Volume显著升高（P<0.01）；RVHI显著升高（P<0.01）；死亡率为42.82%。肺小动脉管壁明显增厚，管腔狭窄，大量炎症细胞侵润。与模型组比较，ICA给药组FS、EF、Stroke Volume明显升高（P<0.01或P<0.05），RVID;d、LV Mass、LV Vol;s明显下降（P<0.01或P<0.05）， LV Vol;d无明显变化；RVHI减轻（P<0.05）；ICA组（60 mg/kg）死亡率为28.57%、ICA组（120 mg/kg）死亡率为14.29%，肺小动脉管壁变薄，管腔增宽，炎症细胞侵润减少。CX3CL1-/-小鼠与野生型小鼠比较：与空白对照组比较，模型组中CX3CL1-/-小鼠FS、EF、LV Vol;d、Stroke Volume高于野生型小鼠，CX3CL1-/-小鼠RVID;d、LV Mass、LV Vol;s低于野生型小鼠，其中FS、EF、LV Vol;d、Stroke Volume（P<0.01或P<0.05），CX3CL1-/-小鼠肺小动脉管壁厚度、管腔大小、炎症细胞量低于野生型小鼠；ICA组CX3CL1-/-小鼠FS、EF、LV Vol;d、LV Vol;s、Stroke Volume高于野生型小鼠，RVID;d、LV Mass低于野生型小鼠，其中ICA组（60 mg/kg） Stroke Volume（P<0.05），ICA组（120 mg/kg）LV Mass（P<0.01），CX3CL1-/-小鼠肺小动脉管壁厚度、管腔大小、炎症细胞量低于野生型小鼠，且ICA组（120 mg/kg）效果高于ICA组（60 mg/kg）。
　　结论：ICA可改善MCT诱导的PAH模型小鼠的血流动力学和肺血管重构，ICA对CX3CL1-/-小鼠PAH模型的改善作用较野生型小鼠差。
　　第二部分：淫羊藿苷通过下调NF-κB/CX3CL1抑制TNF-α诱导的单核细胞向人脐静脉内皮细胞迁移和黏附。
　　目的：研究淫羊藿苷（icariin，ICA）对TNF-α诱导的单核细胞（THP-1）向人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁移和黏附的影响及其机制。
　　方法：⑴免疫荧光染色鉴定CX3CL1、CX3CR1蛋白分别在HUVECs和THP-1表达情况。⑵采用Transwells联合培养THP-1（上室）和HUVECs（下室），分为对照组(control)、模型组(TNF-α)、ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）组和DMSO(溶媒对照，0.1%)组，TNF-α诱导THP-1向HUVECs迁移和黏附，ICA预给药4h后加入TNF-α(10 ng/mL)继续培养24h，移除Transwells，并对培养液中的THP-1计数，即为迁移细胞数；免疫荧光双标法检测THP-1向HUVECs黏附的情况；ELISA检测HUVECs膜结合型CX3CL1（mCX3CL1）、培养基中溶解型CX3CL1（sCX3CL1）蛋白量；Western blot检测HUVECs中CX3CL1、THP-1中CX3CR1、IκB-α、P-NF-κB(p65)蛋白量。⑶选用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）为阳性对照，分析 ICA抑制 THP-1迁移黏附作用与NF-κB/CX3CL1信号通路的关系。将Transwells联合培养的THP-1（上室）和HUVECs（下室）分为对照组(control)、模型组（TNF-α)、ICA10-6 mol/L组、PDTC（50μmol/L）组，ICA和PDTC预给药4h后加入TNF-α继续培养24h；THP-1迁移黏附及sCX3CL1和mCX3CL1蛋白量检测方法同上；免疫荧光检测NF-κB核转录情况；Western blot检测IκB-α、P-NF-κB(p65)蛋白的表达。⑷为了进一步证实ICA抑制THP-1迁移和黏附与CX3CL1的关系，采用Transwells联合培养THP-1和HUVECs，CX3CL1诱导THP-1向HUVECs迁移和黏附，并观察ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）对该模型的影响。ICA预给药4h后加入CX3CL1(50 ng/mL)继续培养24h， THP-1迁移黏附检测方法同上；Western blot检测CX3CR1、P-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平。
　　结果：HUVECs和THP-1有CX3CL1、CX3CR1蛋白表达。与对照组比较，TNF-α(10 ng/mL)能够诱导 THP-1向 HUVECs的迁移和黏附、提高 sCX3CL1、mCX3CL1、CX3CL1和CX3CR1的蛋白水平，激活NF-κB。ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）能抑制TNF-α刺激的THP-1向HUVECs迁移和黏附(P＜0.01或P＜0.05），降低sCX3CL1、mCX3CL1、CX3CL1和CX3CR1蛋白水平(P＜0.01或P＜0.05），抑制NF-κB p65的磷酸化水平和阻断IκB蛋白的降解(P＜0.01或P＜0.05）。PDTC也能起到与ICA同样的作用，ICA的效果稍高于PDTC。此外，与对照组比较，CX3CL1诱导THP-1向HUVECs迁移和黏附的数量明显增多(P＜0.01），伴有CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平升高（P＜0.05）；ICA预处理（10-8～10-6 mol/L）能减少THP-1向HUVECs迁移和黏附的数量（P＜0.05或 P＜0.01），抑制 CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平的上调（P＜0.05或 P＜0.01）。
　　结论：ICA(10-8～10-6 mol/L)可抑制TNF-α/CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs的迁移和黏附，作用机制可能与抑制NF-κB/CX3CL1信号通路有关。

目录

声明

中英文缩略词对照表

第一部分淫羊藿苷改善野百合碱诱导的肺动脉高压模型小鼠血管重构

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分淫羊藿苷通过下调NF-κB/CX3CL1抑制TNF-α诱导的单核细胞向人脐静脉内皮细胞迁移和黏附

前言

1 材料与方法

2.结果

3 讨论

4结论

参考文献

综述：趋化因子CX3CL1及其受体CX3CRl在血管炎症性疾病发展中的作用及研究进展

致谢

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