高胰岛素抑制肾脏尿酸排泄的基础与临床研究以及氯沙坦的干预机制

摘要

研究背景：近年来，代谢综合征（Me tS）的发生率在我国逐年增高，因其与心血管疾病、糖尿病和肾脏疾病的发生率及死亡率密切相关，目前已成为重要的公共卫生健康问题。MetS常伴有较高的高尿酸血症发生率，作为MetS基本病理生理特征的高胰岛素血症及/或胰岛素抵抗（IR）被认为是导致血尿酸水平的升高或高尿酸血症发生的主要原因，而肾脏尿酸排泄下降在血尿酸升高中发挥重要作用。在肾脏中，位于近端肾小管上皮细胞管腔膜和基底外侧膜上的转运蛋白是肾脏转运尿酸的分子基础，其中尿酸转运蛋白-1(URAT1，SLC22A12基因编码)在人体中主要负责尿酸的重吸收，它在维持血尿酸稳定方面扮演重要角色。血尿酸水平的升高或高尿酸血症既是心血管疾病以及肾脏病发生的高危因素，还可以导致代谢综合征相关组分——肥胖、血脂异常和高血压等的发生率增高，甚至可被看作是MetS的组分之一。因此对代谢综合征患者伴发无症状性的血尿酸升高进行干预是十分必要的，有大量证据表明，在高尿酸血症患者中积极控制血尿酸水平对减少心血管事件的发生、保护肾脏功能具有非常有益的作用。目前有关降低血尿酸或促进尿酸排泄的药物因其副作用较大，其临床应用也受到诸多限制。氯沙坦是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）类降压药，人们发现它除了能有效控制患者血压、减少心血管并发症、减少尿蛋白及保护肾脏功能外，还可以降低正常人和高血压患者的血尿酸。总之，高胰岛素血症是否可以促进肾脏尿酸排泄、是否经胰岛素信号通路诱导肾小管上皮细胞表达UR AT1导致血尿酸升高以及具有促进尿酸排泄作用的——氯沙坦是否对这一过程有影响，目前作用机制尚不明确，有必要进一步探讨。
　　目的：本论文拟从临床横断面分析来观察MetS患者血胰岛素与肾脏尿酸排泄之间的关系，从体外实验进一步证实高胰岛素对 HK-2细胞 U RA T1表达及PI3K/Akt1信号通路的影响，并探讨氯沙坦对高胰岛素诱导的HK-2细胞URAT1表达及PI3K/Ak t1信号通路的干预作用，为MetS伴发高尿酸血症的发生机制及其防治提供依据。
　　方法：1.选取2014年3月～2015年3月在我院内分泌科就诊的MetS患者作为研究对象，进行横断面观察。共入选患者108例，其中男性74例，女性34例，平均年龄54.58（55.31±10.68）岁。收集患者基本资料，检测血液各相关生化指标；测定血清空腹胰岛素（FIns）、餐后2h胰岛素（2h PIns）。收集患者24小时尿液，计算肾脏对尿酸排泄相关指标：尿酸排泄分数（FEUA，％）、尿酸清除率（CUA，ml/min/1.73 m2）、单位肾小球滤过尿酸排泄（EurGF，mg/dl/1.73 m2）以及尿尿酸/尿肌酐比值（UUA/Ucr）等；根据中国改良的肾病膳食改良试验（MDRD）方程估算肾小球滤过率（eGFR）。对不同性别的MetS患者之间一般资料、血和尿生化指标以及肾功能相关指标比较；分别将空腹血胰岛素、餐后血胰岛素、HOMA-IR等变量由小到大按照四分位数划分为四组，比较血胰岛素和HOMA-IR等指标不同组别之间的尿酸排泄各指标有无差异；依据MetS等诊断标准，将患者按照性别、不同年龄组、腰围、血压、血糖、血脂、肾小球滤过率、尿蛋白/微量白蛋白、有无糖尿病及高血压病史等指标作为可能的影响因素进行单因素分析，比较不同组间MetS患者尿酸排泄指标的差异；对 MetS患者尿酸排泄指标相关影响因素进行多元回归分析。2.用不同浓度胰岛素刺激人肾小管上皮细胞（HK-2），采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测URAT1在HK-2细胞中的表达情况，从蛋白和核酸水平深入研究不同浓度胰岛素对UR A T1表达的影响；用高浓度胰岛素刺激HK-2细胞，采用Western Blot法检测Akt1、p-Akt1以及URAT1蛋白的表达情况，观察高浓度胰岛素对HK-2细胞PI3K/Akt1信号通路以及URAT1蛋白表达的影响。3.用Western Blot法检测不同浓度氯沙坦（氯沙坦浓度分别为1、10、100μM）干预下高浓度胰岛素诱导的HK-2细胞URAT1蛋白的表达；用Western Blot法检测氯沙坦100μM和PI3K/Ak t通路抑制剂LY294002对高浓度胰岛素诱导的HK-2细胞URAT1、Akt1和p-Akt1蛋白的表达异同。
　　结果：1.（1）在MetS患者中，男性SUA和Sc r水平较女性高(均为P＜0.001)；（2）血胰岛素和 HOMA-IR之间尿酸排泄各指标的比较：随着空腹血胰岛素水平的升高，FEUA明显呈下降趋势（F=8.920，P=0.004）；随着餐后血胰岛素水平的升高，24hUUA（2h PIns≥22.2 mU/L）、FEUA以及CUA呈明显下降趋势（分别为F=7.548，P=0.007；F=9.620，P=0.002；F=15.736，P＜0.001）；HOMA-IR与24hUUA、FEUA、CUA、EurGF和UUA/Ucr的变化趋势无统计学意义（P＞0.05）（；3）MetS患者尿酸排泄影响因素的单因素分析：男性MetS患者的UUA/Ucr水平低于女性(P=0.002)；非老年组(＜60岁) MetS患者的24hUUA、CUA水平均显著高于老年组(≥60岁) MetS患者(P＜0.01)；既往有糖尿病史的MetS患者的CUA水平较既往无糖尿病史的MetS患者的高(P＜0.05)，既往有高血压病史的MetS患者24hUUA、FEUA、CUA、UUA/Ucr等水平均较既往无高血压病史的MetS患者的低(P＜0.05)；收缩压升高组(≥130 mmHg)的MetS患者24hUUA水平低于收缩压正常组(＜130 mmHg)患者(P＜0.05)；根据BMI及腰围分组，MetS患者在24hUUA、FEUA、CUA、EurGF、UUA/Ucr上的差异无统计学意义（P＞0.05）；PBG升高组(≥7.8 mmol/L)较PBG正常组(＜7.8 mmol/L)24hUUA、CUA水平高(P＜0.05)，根据FBG、HbAlc分组，MetS患者在24hUUA、FEUA、CUA、EurGF以及 UUA/Ucr上的差异无统计学意义(P＞0.05)；TG升高组(TG≥1.7 mmol/L)的24hUUA水平高于TG正常组(TG＜1.7 mmol/L)(P＜0.05)。HDL-C降低组(男<1.0 mmol/L，女<1.3 mmol/L)的24hUUA、EurGF均低于HDL-C正常组(男≥1.0 mmol/L，女≥1.3 mmol/L)(P＜0.05)；eGFR≥90 ml/min/1.73 m2组的MetS患者CUA、UUA/Ucr水平均显著高于eGFR＜90 ml/min/1.73 m2组MetS患者(P＜0.01)，≥90 ml/min/1.73 m2组的MetS患者EurGF水平显著低于＜90 ml/min/1.73 m2组MetS患者(P＜0.01)；24 h尿蛋白升高组(24 h尿蛋白≥0.15 g/24h)的MetS患者24hUUA、CUA水平高于24h尿蛋白正常组(24h尿蛋白＜0.15 g/24 h) Me tS患者(P＜0.05)。（4）对MetS患者的血尿酸水平与尿酸排泄指标进行相关分析结果显示：FEUA、CUA、UUA/Ucr这3项指标与SUA水平呈负相关(P＜0.05)。（5）MetS患者5项尿酸排泄指标影响因素的多元回归分析：年龄和餐后胰岛素均与24hUUA呈负相关，餐后血糖与24hUUA呈正相关，在男性患者中，影响24hUUA的主要因素是年龄、HDL-C和餐后胰岛素，女性患者中则主要是年龄、尿蛋白以及甘油三酯；餐后血糖与 FEUA呈正相关，空腹胰岛素与 FEUA呈负相关，在男性患者中，影响 F EUA的主要因素是空腹胰岛素，女性患者中的影响因素则主要是餐后血糖；eGFR、餐后血糖与CUA呈正相关，餐后胰岛素与CUA呈负相关，在男性患者中，影响CUA的主要因素是eGFR、餐后胰岛素，女性患者中的影响因素则主要是餐后血糖与年龄；eGFR、BMI均与EurGF呈负相关；eGFR与UUA/Ucr呈正相关，既往高血压病史与UUA/Ucr呈负相关，在男性患者中，影响UUA/Ucr的主要因素是eGF R，女性患者中的影响因素则主要是既往高血压病史与餐后血糖。2.不同浓度胰岛素培养HK-2细胞UR A T1的mRN A和蛋白表达较空白对照组明显升高，且随着干预时间延长及胰岛素浓度的增加而表达量呈递增趋势（均P＜0.05），URAT1 mRNA和蛋白在胰岛素100 nM干预48小时表达量达到高峰（分别较对照组升高1.57和1.80倍,均P＜0.05），因此在后续实验中均采用此浓度及时间观察；与对照组比较，高浓度胰岛素（100 nM）可以增加p-Akt1蛋白的表达（P＜0.05），提示胰岛素可以活化PI3K/Akt1信号通路；与对照组比较。LY294002可抑制高浓度胰岛素诱导的Akt1活化，可显著减少 p-Akt1的表达（P＜0.01）；与高浓度胰岛素组比较。LY294002可抑制高浓度胰岛素诱导的URAT1蛋白表达（P＜0.05）。3.应用不同浓度氯沙坦干预HK-2细胞后，URAT1蛋白表达下降，且随氯沙坦浓度的增高，URAT1表达逐渐下降，与高胰岛素组存在明显差异（P＜0.01）；与正常对照组比较，高浓度胰岛素诱导的HK-2细胞内URAT1及p-Akt1表达明显增加（P＜0.05），而Ak t1的表达并无明显差异；与高浓度胰岛素组比较，应用氯沙坦100μM干预HK-2细胞后p-Akt1及URAT1的表达下降（P＜0.05），应用LY294002干预HK-2细胞后p-Akt1及URAT1的表达显著下降（P＜0.01），且其效应较而氯沙坦100μM干预组更强（P＜0.05），Akt1的表达并无明显差异（P>0.05）。
　　结论：1.血胰岛素水平升高是抑制肾小管尿酸排泄而导致血尿酸增高的主要影响因素，在代谢综合征性高尿酸血症的发生机制中起着非常重要的作用；男性代谢综合征患者较女性的血尿酸水平明显增高，肾脏尿酸排泄能力下降可能是导致其血尿酸升高的原因之一，而血胰岛素水平升高是它的独立影响因素。因此，在代谢综合征患者中改善高胰岛素血症对于预防血尿酸升高乃至高尿酸血症具有积极意义。2.胰岛素可通过时间与浓度依赖性的方式诱导人肾小管上皮细胞URAT1的表达，胰岛素经上调 URAT1的表达来促进尿酸在近端肾小管的重吸收，这可能是MetS所致血尿酸升高或高尿酸血症的发生机制之一；高浓度胰岛素经活化 PI3K/Akt1信号通路而上调HK-2细胞URAT1的表达。3.氯沙坦对高浓度胰岛素诱导的HK-2细胞上调表达URA T1有明显的抑制作用，其抑制作用随着浓度的增大而增强，呈浓度依赖性；氯沙坦可经部分抑制肾小管上皮细胞PI3K/Akt1信号通路的活性而抑制高胰岛素诱导的HK-2细胞URAT1上调表达，从而在伴高胰岛素血症状态的MetS所致血尿酸升高或高尿酸血症中起到抑制肾小管对尿酸的重吸收、促进尿酸排泄而降低血尿酸的作用。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

前言

实验设计路线

参考文献

第一部分 代谢综合征患者血胰岛素及相关组分对肾脏尿酸排泄的影响临床研究

研究背景

对象与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 高胰岛素对人HK-2细胞URAT1表达及PI3K/Akt1信号通路的影响研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 氯沙坦对高胰岛素诱导的HK-2细胞URAT1表达及PI3K/Akt1信号通路的影响

研究背景

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

英文缩略词

攻读学位期间发表的论文

致谢