TGF-β1和MGF对家兔骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

摘要

目的：探讨兔骨骼肌卫星细胞分离提取和培养方法，并观测TGF-β1、MGF在不同浓度和时间对体外培养的兔骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响。
　　方法：⑴选取一周齢健康乳兔，采用改良混合酶消化结合差速贴壁法，分离提取骨骼肌卫星细胞（SMSCs），原代培养行Desmin免疫细胞化学法鉴定；⑵取生长良好的第三代SMSCs以8x103个/mL的密度接种于96孔板，设对照组、不同浓度梯度的TGF-β1组(0.5、1、2、5、10、20ng/mL)和MGF组(15、30、45、75、100、125ng/mL)，加药后各组继续培养6d，显微镜下观察细胞的生长情况，每间隔24h，CCK-8法检测各组的OD值，确定相对最佳作用的TGF-β1和MGF浓度；⑶CCK-8法检测相对最佳作用浓度下TGF-β1组、MGF组和TGF-β1+MGF组及对照组的OD值，Real time PCR检测（对照组、TGF-β1组和MGF组）第0、2、4、6天Myf5和Myogenin mRNA水平变化。
　　结果：①分离提取的家兔细胞经免疫细胞化学Desmin染色呈强阳性表达。②第4天增殖效果显现，10ng/mL组OD值显著高于对照组及其他浓度组(P<0.01)；第5天，各浓度实验组OD值均高于对照组(P<0.01)，其中10ng/mL组 OD值显著高于其他各组(P<0.01)，20ng/mL组 OD值显著高于0.5ng/mL、1ng/mL组、2ng/mL组、5ng/mL组（P<0.05）；第6天，各实验组OD值均高于对照组(P<0.01)，其中10ng/mL组OD值显著高于其他各组(P<0.01)，0.5ng/mL组OD值低于1ng/mL组、2ng/mL组(P<0.01)，1ng/mL组OD值与2ng/mL组无显著差异(P>0.05)。确定10ng/mL TGF-β1为相对最佳效应浓度值。③第2天增殖效应开始显现，各剂量实验组OD值均显著高于对照组(P<0.01)，100ng/mL组OD值显著高于15ng/mL组、30ng/mL组、45ng/mL组(P<0.05)；第3、4、5天各组的OD值进一步增高，但整体上升趋势同第2天；第6天，45ng/mL组、75ng/mL组、100ng/mL组、125ng/mL组OD值均显著高于对照组(P<0.01)，而15ng/mL组、30ng/mL组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)，且其OD值均显著低于45ng/mL组、75ng/mL组、100ng/mL组、125ng/mL组(P<0.01)，100ng/mL组的OD值均显著高于其余各组(P<0.01)。确定100ng/mL的MGF为最佳效应浓度值。④第2天，MGF组（100ng/mL）OD值显著高于对照组(P<0.01)，而TGF-β1组（10ng/mL）和TGF-β1+MGF组的OD值与对照组比较无显著差异(P>0.05)；第3天至第6天，TGF-β1组、MGF组的OD值均显著高于对照组(P<0.01)，同时MGF组的OD值显著高于TGF-β1组的(P<0.01)，但TGF-β1+MGF组OD值与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。⑤对照组、TGF-β1组、MGF组Myf5的mRNA表达量呈先上升后下降的趋势， Myogenin呈低量弱表达后缓慢上升的趋势。TGF-β1组第4天Myf5的mRNA表达量高于第0天(P<0.01)，虽也高于同期的对照组，但无显著性差异(P>0.05)；TGF-β1组Myogenin的mRNA表达量在6天的细胞培养期内与同期的对照组比较无显著性差异(P>0.05)。MGF组第2天Myf5的mRNA表达量显著高于同期的对照组及TGF-β1组(P<0.05)，第4天的表达量虽高于同期对照组及TGF-β1组，但也均无显著性差异(P>0.05)；MGF组Myogenin在第4天、6天的mRNA表达量均显著低于对照组和TGF-β1组(P<0.05)。
　　结论：⑴采用混合酶消化结合差速贴壁法成功分离提取家兔骨骼肌卫星细胞，实现肌卫星细胞的体外培养和鉴定。⑵TGF-β1在0.5～20ng/mL范围内对兔SMSCs有促增殖效应，以10ng/mL时促增殖效果相对最佳，但对兔SMSCs抑制分化的作用较弱。⑶MGF在15～125ng/mL范围内对兔SMSCs有促增殖效应，以100ng/mL时促增殖效果相对最佳，且该浓度对兔SMSCs有较强的抑制分化效应。⑷相对最佳浓度TGF-β1和MGF作用于兔SMSCs时，MGF促增殖效果强于TGF-β1，但二者联用时并无明显促增殖效应。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

1 材料

1.1 实验动物

1.2 实验仪器设备

1.3 实验试剂

2 实验方法

2.1 动物的消毒与肌肉取材

2.2 肌卫星细胞的提取、纯化及培养

2.3 卫星细胞鉴定

2.4 肌卫星细胞的传代培养

2.5 CCK-8法检测TGF-β1对肌卫星细胞增殖分化的影响

2.6 CCK-8法检测MGF对肌卫星细胞增殖分化的影响

2.7 CCK-8法检测相对最佳作用浓度的TGF-β1、MGF及联用对肌卫星细胞增殖分化的影响

2.8 Real-time PCR检测相对最佳作用浓度TGF-β1和MGF作用下肌卫星细胞Myf5、Myogenin 的mMRA水平

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 SMSCs的提取、培养及鉴定

3.2 不同浓度TGF-β1对肌卫星细胞增殖分化的影响

3.3 不同浓度MGF对肌卫星细胞增殖分化的影响

3.4 相对最佳作用浓度TGF-β1和MGF对肌卫星细胞增殖分化影响

3.5 相对最佳浓度TGF-β1和MGF作用肌卫星细胞Myf5、Myogenin的mMRA水平

4 讨论

4.1 SMSCs的提取、培养及鉴定

4.2 TGF-β1和MGF单独及联用对兔SMSCs增殖及分化的影响

5 结论

参考文献

综述:细胞因子对骨骼肌卫星细胞增殖分化影响的研究进展

致谢

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