脉冲染料激光对创面上皮间充质转化及瘢痕形成的影响

摘要

目的：探讨脉冲染料激光(Pulsed dye laser,PDL)对兔耳创面上皮细胞向间质细胞转化的影响及该现象对瘢痕形成的关系。 方法：1、兔耳腹侧增生性瘢痕（Hypertrophic scar,HS）模型的建立：选取月龄大小在4-5月之间、不区分雌雄、公斤体重在2.4±0.20kg的健康成年家兔12只，兔耳腹侧面毛发在实验开始前刮除，常规消毒兔耳周围皮肤、铺巾，3%戊巴比妥钠（3%Ne mbutal,3ml/kg）耳缘静脉麻醉，在使用自研环形钻刀沿各兔耳腹侧长轴建立6个直径10mm，每个瘢痕间隔0.5cm，深达皮下软骨的皮层缺损创面（操作注意避开肉眼可见血管），共计144个。术后压迫止血，自由进食，金霉素眼膏抗感染、三天一次定期换药、观察伤口愈合、记录瘢痕形成情况。 2、实验分组：建模后4周，16个瘢痕模型不符合选取标准，予以排除，剩余瘢痕兔耳左侧68个，右侧60个，共有128个创面愈合、脱痂，形成突出于正常皮肤的增生性瘢痕。按照兔耳瘢痕顺时针依次编号，然后按随机数字表法将各组瘢痕模型分成A/B/C/D 4组，每组32个瘢痕，A/B/C组作为治疗组(采用595nm脉冲染料激光进行治疗，治疗参数及模式分别为：波长595nm，光斑直径7mm，发射频率2Hz，脉宽20ms，能量密度12J/cm2，间隔时间及动态冷却时间均为20ms，每个瘢痕重复3次照射)，A组每周进行1次PDL照射，B组每两周进行1次PDL照射，C组每3周进行1次PDL照射，共计8周，D组为对照组不予干预。 3、大体观察：每次PDL治疗前后分别观察、记录各组HS组织色泽、质地、便携式超声测量瘢痕组织的厚度。 4、组织学观察：8周PDL治疗结束后统一取材，4%多聚甲醛固定瘢痕团块，常规脱水、包埋，行HE染色、免疫组化检测各组TGF-β1、E-cadherin、Vimentin表达情况。 5、统计学分析：数据的统计学处理采用SPSS 20.0统计软件包，计量资料用均值（x±s）表示，在进行方差齐性检验和正态分布检验后，组间的比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。 结果：1、大体观察：建模术后经过不同周期PDL治疗，A、B组与同期C、D组相比瘢痕表面较为平坦，瘢痕色泽与正常兔耳腹侧肤色相似，质地柔软，C组和D组差异不明显。 2、瘢痕厚度的测量：建模完成后各组均有瘢痕增生，但瘢痕厚度无明显差异（P>0.05）；PDL治疗后4周开始，A、B治疗组瘢痕厚度显著小于同期D组（P<0.05）；与对照组D比较，治疗组C的各瘢痕厚度无明显差异性(P>0.05)。 3、HE染色：激光治疗A、B组中，瘢痕组织内胶原纤维排列稀疏，成纤维细胞、炎性细胞数量少，血管细小、排列均匀；在C组及对照组D组中，瘢痕真皮组织明显增生变厚，其内可见炎性细胞浸润，数量较多，排列紊乱旋涡样排列。 4、SP免疫组化染色：A、B组中细胞因子TGF-β1、Vim的细胞面积、细胞数量较对照组D组明显减少(P<0.05)；而细胞因子E-cad面积、细胞数量则较D组明显增多(P<0.05)。 结论：1、脉冲染料激光可能通过干预上皮间充质转化的表达产生瘢痕抑制作用。 2、治疗周期为两周较为适宜。

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中英文缩略词表

前 言

1 材料与方法

1.1 实验动物及相关准备

1.2 实验主要仪器、试剂

1.2.1 主要实验仪器

1.2.2 主要实验试剂

2 实验方法及步骤

2.1 兔耳HS模型制作及实验分组

2.1.1 兔耳HS模型制作

（1）准备工作

备好无菌手术包、自研直径为10mm的环形环钻、无菌圆刀、眼科剪、无菌纱布等物品，操作者洗手、戴帽子、

（2）术中

手术操作时避开明显可见的血管、注意观察家兔的呼吸和心率是否异常。用自制圆形环钻(直径约为1.0cm)

（3）术后

2.1.2 实验分组

（1）瘢痕入选标准：瘢痕局部增生范围在原创缘范围内，质地硬、颜色红色、中央呈乳头状突起、明显突出周围

（2）实验分组：建模后4周，16个瘢痕不符合选取标准，予以排除，剩余瘢痕兔耳左侧68个，右侧60个，

（3）激光治疗：同一实验人员在同一环境下，采用相同模式的595nm PDL进行治疗。A组每周进行1次

2.2 脉冲染料激光仪及其参数设置

2.3 实验方法

2.3.1 增生性瘢痕的厚度测量

2.3.2 HS标本的切取

各组均在8周PDL治疗结束后统一取材，采用3%Nembutal（3ml/kg）行耳缘静脉麻醉。常规消

2.3.3 准备载玻片

100％乙醇 1h(50℃)；100％乙醇1h(50℃)

（3）浸蜡：二甲苯(50℃) 5min→二甲苯(50℃) 5min→石蜡(62℃) 30min→石蜡

（4）包埋切片：每块组织四周留约2 mm的石蜡边,切除周围过多的石蜡→冷却→装于切片机固定器上→切成

（5） 脱蜡水洗：二甲苯I中脱蜡l0min→二甲苯II中10min，→95％酒精15 min→95％

2.3.5 苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色

（1）苏木精染色5min。

（2）自来水充分水洗3min。

（3）0.5％盐酸酒精溶液分化，数秒。

（4）镜检着色的程度（如不适宜做相应调整）。

（5）自来水充分水洗2min。

（6）饱和碳酸铿溶液返蓝30sec。

（7）自来水充分水洗20min。

（8）蒸馏水洗3min×3次。

（9）伊红染液染色2min。

（10）80％酒精30sec→95％酒精30sec→无水酒精I 2min→无水酒精II 2min→石

（11）染色结果判定：血管、红细胞、胶原纤维、胞浆被染成不同程度的红色，细胞核蓝染。

2.3.6 SP免疫组织化学方法

（1）将切片依次浸泡入甲醛、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各5分钟脱蜡和水化；

（2）PBS清洗3遍后，用3%过氧化氢甲醇室温下封闭内源性过氧化物酶活性10分钟；

（3）PBS清洗3遍后，将切片置于柠檬酸盐缓冲液中用微波炉加热至沸腾，然后自然冷却至室温；

（4）PBS清洗3遍后，将血清封闭液滴于组织处放入37℃恒温烤箱中封闭30分钟；

（5）取出样本后将每块切片加入事先用PBS稀释好的一抗抗体，放入4℃冰箱过夜；

（6）将切片盒从冰箱取出后放入37℃恒温烤箱复温1小时后，PBS清洗三遍，加SABC试剂37℃孵育3

（7）PBS清洗三遍后，用生物素过氧化物酶标记的山羊二抗继续37℃孵育30分钟；

（8）将DAB试剂取出解冻，用双蒸水稀释好后，滴入组织上，在显微镜下观察染色；

（9）待组织中腺体呈现阳性反应（棕黄色），间质未被染黄时及时用PBS洗去DAB试剂，然后再用双蒸水清

（10）复染后用双蒸水清洗三遍，再用PBS清洗三遍，再依次放入70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、1

（11）中性树脂封片。

（12）染色结果判定：SP免疫组织化学方法中阳性细胞胞浆为棕黄色。

注：首先进行预试验，确定一抗工作液的浓度，TGF-β1抗体稀释比例为1:250；E-cad和Vime

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 瘢痕生长大体观察

3.3 增生性瘢痕厚度测量结果

3.4 苏木精-伊红(HE)染色

3.5 兔耳瘢痕组织内TGF-β1、E-cad和Vimentin表达检测

4 讨论

5 结论

参考文献

综 述

参考文献

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