低浓度壬基酚长期暴露对大鼠糖代谢的影响

摘要

环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors,EEDs)暴露可能诱发糖脂代谢紊乱，增加Ⅱ型糖尿病、肥胖等代谢综合征的发病风险。壬基酚（nonylphenol,NP）作为EEDs的典型代表，可通过消化道、皮肤接触等途径被机体吸收并随血液分布到多种组织和器官内蓄积。中国及欧美多个国家人群尿液中均能检出NP。体外培养提示NP暴露可导致β细胞分泌功能障碍。围产期NP暴露可引起F1、F2子代出现典型的代谢综合征症状。虽然相关研究证实了NP会对机体产生有害作用，但是染毒剂量远远高于环境中人群实际NP暴露剂量。为了更好的接近普通人群NP的环境暴露，并进一步探究NP是否有低剂量效应，在NP染毒剂量方面采取环境浓度相同数量级设计，设定为0.02，0.2，2μg/kg/day三个剂量梯度。本研究通过灌胃的方式模拟人群接触NP的主要途径，进行长期低浓度NP暴露，建立动物模型。初步探讨低浓度NP长期暴露是否影响胰腺糖代谢功能及其可能存在的作用机制。高脂饮食是导致胰岛素抵抗发生的重要因素之一，本实验还探究了不同剂量NP暴露是否促进高脂饮食致糖代谢紊乱的作用。 第一部分 低浓度壬基酚长期暴露致大鼠糖代谢紊乱的研究 目的：探究低浓度NP长期暴露对大鼠胰腺糖代谢功能的影响。 方法：SPF级SD大鼠(150±10) g，雌雄各半，随机分为4组，20只/组。分组如下：对照组(C组，玉米油)，低剂量(L组，0.02μg/kg/day NP)，中剂量组(M组，0.20μg/kg/day NP)，高剂量组(H组，2.00μg/kg/day NP)。灌胃体积为5 ml/kg.bw。每日晨连续空腹灌胃NP180天。90天时进行大鼠口服糖耐量试验（OGTT）；180天后麻醉处死大鼠。定期监测大鼠体重和空腹血糖水平（FBG）变化；ELISA检测大鼠血清空腹胰岛素（FINS）水平；镜下观察大鼠胰腺组织病理结构改变；高效液相色谱法（HPLC）检测大鼠血清和胰腺中NP含量；RT-qPCR和Western Blot检测葡萄糖激酶(Glucokinase,GCK)、解偶联蛋白-2 (uncoupling protein 2,UCP-2)、葡萄糖转运蛋白2（Glucose transporter 2,GLUT-2）等糖代谢相关基因和蛋白的表达。 结果：1.与对照组比较，NP（低、中、高剂量）暴露180天导致大鼠胰腺质量降低（F=109.905,P＜0.001），胰腺系数减小（F=136.200,P＜0.001）。NP暴露剂量与大鼠胰腺重量与系数的变化存在剂量-效应关系，即胰腺重量和胰腺系数随着NP暴露剂量升高而减小。 2．与对照组比较，NP（低、中、高剂量）暴露可致大鼠空腹血糖升高（F90 天=189.311,P180天＜0.001;F180天=160.785,P180天＜0.001）。NP暴露剂量与空腹血糖水平存在剂量-效应关系，即空腹血糖水平随着 NP 暴露剂量升高而升高。与对照组比较，NP（低、中、高剂量）暴露可致大鼠180天空腹胰岛素水平降低（F=100.89, P＜0.001）。与对照组比较，NP 暴露（低、中、高剂量）组大鼠瘦素水平升高（F=76.628,P＜0.001）。 3．与对照组比较， NP暴露90天可导致大鼠口服糖耐量异常，OGTT曲线下面积增大（F=361.423,P＜0.001）。NP染毒剂量与大鼠OGTT曲线下面积（The area under curve of OGTT,OGTT-AUC）呈剂量-效应关系，OGTT-AUC随着NP暴露剂量增加而增大。 4．与对照组比较，NP（低、中、高剂量）暴露可致 90 天胰岛素抵抗指数增大（F=196.857,P＜0.001）和胰岛素敏感指数减小（F=199.032,P＜0.001）。 5．与对照组比较，NP暴露（L、M、H组）可致大鼠90天，180天血清（F 血清90天=322.289,P 血清90天<0.001;F 血清180天=396.446,P 血清180天<0.001）与胰腺组织（F 胰腺90天=501.091,P 胰腺90天<0.001;F 胰腺180天=534.124,P 胰腺180天<0.001）中NP浓度升高，血清与胰腺组织中NP浓度与NP暴露剂量之间存在剂量-效应关系，即血清与胰腺中NP浓度随着NP暴露剂量增加而升高。 6．与对照组比较，NP 暴露组（L、M、H 组）均出现不同程度胰腺细胞胞质疏松，细胞水肿、坏死，胰腺细胞出现淋巴细胞浸润，随着NP暴露剂量增加病理改变加重。 7．与对照组比较，NP暴露（L、M、H组）可致大鼠胰腺180天葡萄糖激酶（GK） （F=131.434,P<0.001）和葡糖糖转运蛋白2（GLUT-2）（F=245.555,P<0.001）基因相对表达量下调，解偶联蛋白（UCP-2）基因相对表达量上调(F=109.761,P＜0.001)。 8．NP暴露180天后，与对照组比较，NP暴露（L、M、H组）可致大鼠胰腺葡萄糖激酶（ GK ）（ F=240.362,P＜0.001 ）和葡糖糖转运蛋白 2 （ GLUT-2 ）（F=360.413,P＜0.001）的蛋白相对表达量下调，胰腺解偶联蛋白（UCP-2）蛋白相对表达量下调(F=103.312,P＜0.001)。 结论：1. 低浓度NP（0.2,2μg/kg/day）暴露180天后可在血清和胰腺中蓄积，造成胰腺病理损伤，诱导大鼠糖耐量异常和胰岛素抵抗，诱发大鼠糖代谢紊乱。2．低浓度NP（0.2,2μg/kg/day）暴露180天后胰腺UCP-2、GK和GLUT-2等糖代谢关键基因和蛋白的表达异常，这可能是NP暴露致糖代谢紊乱的机制之一。 第二部分 壬基酚促进高脂饲料致大鼠糖代谢紊乱的研究 目的：探讨不同剂量NP联合高脂饲料暴露对大鼠糖代谢的影响是否存在交互效应。 方法：SPF级SD大鼠(150±10)g，雌雄各半，随机分为8组，20只/组。分组如下：普通饲料对照组(C组，玉米油+普通饲料)，普通饲料低剂量(L组，0.02μg/kg/day NP+普通饲料)，普通饲料中剂量组(M组，0.20μg/kg/day NP+普通饲料)，普通饲料高剂量组(H组，2.00μg/kg/day NP+普通饲料)，高脂饲料对照组(CH组，玉米油+高脂饲料)，高脂饲料低剂量组（LH组，0.02μg/kg/day NP+高脂饲料），高脂饲料中剂量组（MH组，0.20μg/kg/day NP+高脂饲料），高脂饲料高剂量组(HH组，2.00μg/kg/day NP+高脂饲料）。灌胃体积为5 ml/kg，连续灌胃NP180天。糖代谢相关生化指标及分子检测方法同第一部分。 结果：1. 与普通饲料对照组比较，高脂饲料对照组大鼠90天、180天体重呈增加趋势（P90天=0.556，P180天=0.970），90 天、180 天空腹血糖水平升高（P90天＜0.001,P180天＜0.001），90天空腹胰岛素水平升高(P90天=0.003)，180天空腹胰岛素水平降低（P180天＜0.001），90天口服糖耐量异常，OGTT曲线下面积（OGTT-AUC）增大（P＜0.001），90天、180天胰岛素抵抗指数增大（P90天＜0.001, P180天＜0.001）， 90天、180天胰岛素敏感指数减小（P=0.034,P＜0.001）。 2. 与普通饲料对照组比较，高脂饲料对照组胰腺组织出现轻度水肿，RT-qPCR结果显示：高脂饲料对照组胰腺GK与GLUT-2的基因相对表达水平均下降（PGK＜0.001,PGLUT-2＜0.001），UCP-2 基因相对表达量增加（PUCP-2＜0.001），WB 结果显示：高脂饲料对照组胰腺GK、GLUT-2及UCP-2的蛋白相对表达水平均下降（PGK＜0.001,PGLUT-2＜0.001, PUCP-2=0.001）。 3．NP(低、中、高剂量) 联合高脂饲料暴露对大鼠180天空腹血糖的影响存在交互效应(F 低=14.582,P 低=0.001;F 中=4.981,P 中=0.032;F 高=12.359,P 高=0.001）；对大鼠OGTT-AUC的影响存在交互效应（F 低=34.865,P 低＜0.001;F 中=4.853,P 中=0.034;F高=65.007,P 高＜0.001）。低剂量（F90天=19.624,P90天＜0.001;F180天=44.020,P180天＜0.001）、中剂量(F90天=10.959,P90天=0.002;F180天=50.540,P180天＜0.001）、高剂量（F90天=31.728,P90天=0.001;F180天=24.983,P180天＜0.001）NP联合高脂饲料暴露对90天、180 天胰岛素敏感指数的影响存在交互效应。NP(低、中、高剂量) 联合高脂饲料暴露对180天胰岛素抵抗指数的影响存在交互效应（F 低=31.488,P 低＜0.001;F中=49.972,P 中＜0.001;F 高=15.139,P 高＜0.001）。NP(低、中、高剂量) 联合高脂饲料暴露对胰腺UCP-2基因的表达量存在交互效应（F 低=54.624,P 低＜0.001；F 中=45.16,P 中＜0.001；F 高=246.982,P 高＜0.001），对胰腺 GLUT-2 蛋白表达量的影响存在交互效应(F 低=17.137,P 低＜0.001;F 中=38.198,P 中＜0.001;F 高=4.847，P 高=0.048)。 4．低剂量 NP 联合高脂饲料暴露对大鼠 90 天空腹血糖的影响存在交互效应（ F=8.785,P=0.005 ），对大鼠 90 天胰岛素抵抗指数的影响存在交互效应（F=6.429,P=0.016）。 5．中剂量NP联合高脂饲料暴露对90天和180天空腹胰岛素水平的影响存在交互效应(F90天=5.521,P90天=0.024;F180天=15.884,P180天＜0.001)，对胰腺GK基因相对表达量的影响存在交互效应(F=10.307,P=0.004)，对胰腺UCP-2的蛋白表达量存在交互效应(F=14.191, P=0.003)。 6．高剂量NP联合高脂饲料暴露对胰腺GK和GLUT-2两个基因相对表达量的影响存在交互效应(FGK=6.629,PGK=0.018;FGLUT-2=7.45,PGLUT-2=0.013），对胰腺GK和 UCP-2 两个蛋白表达量的影响存在交互效应(FGK=4.847,PGK=0.048;FUCP-2=103.780, P UCP-2＜0.001)。 结论：NP和高脂饲料联合暴露可增加糖代谢紊乱发生风险，在0.20μg/kg/day、2.00μg/kg/day剂量下联合作用最明显。

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