灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究

摘要

背景：肝细胞性肝癌是发病率和死亡率高且预后极差的恶性肿瘤之一。目前临床的治疗方法包括外科手术切除、TACE术、放化疗、免疫治疗、基因治疗等，但大多难以控制疾病的进展。化学药物治疗是目前使用最多的方法，但所应用的化疗药物对病人的毒副作用较大且疗效不高。因此研发既有抗癌活性同时毒副作用低的新型抗肿瘤药物一直是研究的重点。近些年从天然产物中提取有效抗肿瘤活性成分已成为一种新的研究趋势。灰树花多糖（Grifola frondosa polysaccharide。GFP）是从药食同源菌种灰树花子实体及菌丝体中提取出的一种具有广泛药理作用的活性物质。已有研究报道过GFP对肿瘤细胞的增殖具有较显著的抑制作用，且抗肿瘤效应的分子机制为诱导细胞凋亡。同时维生素C（Vitamin C，VC）也曾被报道过在体外实验中具有诱导骨肉瘤细胞凋亡和诱导骨髓基质细胞自噬的作用。
　　目的：通过对灰树花多糖抗肿瘤的文献进行计量学分析，同时对多糖抑瘤效应中凋亡的作用进行Meta分析的研究方法，来了解灰树花多糖抗肿瘤方面研究的现状并探讨多糖抗肿瘤主要的分子机制，并在此基础上进行下一步的实验研究。探讨联合应用灰树花多糖和维生素C对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响，验证二者在抗肿瘤效应上是否具有协同增效作用，此外阐明凋亡与自噬在联合用药治疗肝癌细胞过程中发挥的作用，并进一步探讨联合用药诱导肝癌细胞凋亡和自噬发生的具体分子机制，为有效指导临床实践用药，开拓临床治疗肝癌新思路提供实验基础。
　　方法：对灰树花提取物生物活性的相关研究文献进行计量学分析，并应用可视化技术对灰树花多糖抗肿瘤研究的现状进行全面的了解。其次通过系统评价与Meta分析的方法对灰树花多糖抑瘤作用的分子机制进行分析，探讨灰树花多糖抗肿瘤效应中诱导细胞凋亡的作用。随后进行实验研究，对于从灰树花子实体中提取出来的多糖以及常规药物维生素C，采用MTT法分别检测单用药和联合用药后对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响；应用等效线图解法研究联合用药时二者之间的相互关系并寻求最佳联合用药浓度；流式细胞术检测联合用药对细胞周期的影响；Annexin V-FITC/PI双染色法检测对细胞凋亡的诱导作用；用倒置生物显微镜观察药物干预后SMMC-7721细胞形态学的改变，并进一步用透射电镜观察细胞的超微结构变化；同时用Hoechst33258凋亡荧光染色剂和MDC自噬荧光染色剂对细胞进行处理后，通过荧光显微镜观察细胞凋亡和自噬的发生情况；应用Western blotting（WB）法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、PARP及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、Akt和phospho-Akt蛋白的表达情况；通过比较全细胞蛋白和胞质蛋白中细胞色素C的表达量来判断此过程中是否有细胞色素C的释放；另外分别检测药物处理后细胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性变化情况。从分子生物学水平检测细胞凋亡与自噬水平的改变，并探讨此过程中细胞遵循何种信号转导通路发生凋亡和自噬。
　　结果：文献分析结果显示，在对灰树花提取物生物活性的诸多研究中，灰树花多糖的抗肿瘤效应一直是研究的重点与热点，而系统评价和Meta分析结果表明诱导肿瘤细胞发生凋亡是其发挥抑瘤效应的主要机制。实验结果显示，灰树花多糖和维生素C均可抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖，且呈时间-剂量依赖性。等效线图解法分析结果表明小剂量的GFP（<0.6 mg/ml）与VC联合应用时，二者具有协同增效抗肿瘤作用，根据MTT结果最终选定联合用药浓度为0.2mg/ml GFP联合0.3mM VC，此时联合用药对SMMC-7721细胞抑制率为68.81％±1.12，高于单用GFP（16.03%±1.80）和VC（29.85%±1.02）。流式细胞术检测结果显示联合用药后细胞发生G2/M期阻滞，且细胞凋亡率从对照组的3.22%±0.23上升至联合用药组的64.45%±1.41，而联合用药组的细胞凋亡率分别是GFP组的6.88倍和VC组的2.24倍。药物处理肝癌细胞24小时后，光学显微镜与透射电镜下均可观察到细胞形态发生改变，出现染色质边集、胞质疏松等早期凋亡现象，同时在胞质中可观察到有双层膜结构的自噬泡出现。Hoechst33258染色后，GFP、VC及联合用药处理的细胞中均可观察到典型的细胞核偏向一侧的凋亡细胞核变化情况。MDC染色后VC与联合用药干预后可在细胞胞质中见到荧光加强的自噬颗粒，且凋亡与自噬现象均是联合用药组更加明显。WB结果显示联合药物干预后，与对照组相比，促凋亡蛋白Bax表达上调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降、caspase-3底物PARP表达增强。同时对照组、GFP、VC与联合用药组四个组全细胞蛋白中的细胞色素C表达无差别，而除对照组外其余三个组细胞的胞质蛋白中细胞色素C表达增强，说明药物干预后细胞色素C释放到胞质中。此外，联合用药后细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均增强。提示联合用药后肝癌细胞SMMC-7721凋亡水平上升，且主要遵循内源性线粒体途径发生凋亡。WB结果同时显示，联合用药后细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达增强、自噬分子标志物LC3-II表达上调，LC3-II/LC3-I比例上升，说明细胞自噬活性增强，但在接下来的WB实验中，细胞总Akt和phospho-Akt蛋白表达均增强，说明经典负性调控的自噬信号转导途径PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号转导通路可能不参与此过程。
　　结论：文献计量学分析结果表明，灰树花多糖的抗肿瘤作用一直是其生物活性研究的重点。Meta分析结果也显示，多糖抑瘤效应主要的分子机制为诱导肿瘤细胞凋亡。进一步的实验结果提示，小剂量的GFP联合VC对肝癌细胞SMMC-7721具有显著的抗肿瘤活性，且二者具有协同增效作用。药物干预后细胞的凋亡和自噬均被激活，药物一方面通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡，另一方面诱导细胞发生自噬，从而发挥抑制肿瘤的效应。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

缩略词表 I

目录

第一章 前 言

一、研究背景

二、研究目的

三、研究内容

四、研究方法

五、技术路线

参考文献

第二章 灰树花多糖抗肿瘤研究的文献计量学分析

一、研究背景

二、方法

三、 结果

四、讨论

五、 结论

参考文献

第三章 灰树花多糖抑瘤效应中凋亡作用的Meta分析

一、资料和方法

二、 结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第四章 灰树花多糖联合维生素 C对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

一、实验材料

二、 实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第五章 灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡和自噬的分子机制

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第六章 结 论

一、主要结论

二、特色与创新

三、局限性与不足

四、研究展望

在学期间的研究成果

致谢