微小RNA-21、RNA-155与蛋白OPN、TGFBI在膀胱尿路上皮癌中的诊断及临床意义的研究

摘要

背景：膀胱癌（bladder cancer）是最常见的泌尿系肿瘤之一。据我国据肿瘤登记中心数据显示，2008年全国膀胱癌发病率高达7.49/10万，其中城市男性发病率最高（13.07/10万），而国际标化发病率仅为4.53/10万，数据也显示膀胱癌是我国男性发病率最高的泌尿生殖恶性肿瘤。膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）占膀胱癌的百分之九十以上，经尿道膀胱肿瘤电切（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）术后复发率较高，1年复发率达15-61％，5年高达31-78%。由于膀胱尿路上皮癌有较高复发率，需要长期监测、治疗必然会给患者带来较大的经济压力。因此，对于膀胱尿路上皮癌更需要一种有效的方法或技术来及时诊断和监测，争取最佳的治疗时期，减少膀胱尿路上皮癌进一步进展，降低患者的经济压力。膀胱镜检查、尿脱落细胞学检查是膀胱尿路上皮癌诊断的经典方法。膀胱镜检查具有较高的敏感性及特异性，但具有创伤性、存在并发症的可能，如泌尿系感染、疼痛、出血等，长期检查也会带来较高的花费；尿脱落细胞学检查在诊断NMIBC时具有较高的特异性为86-90%，但敏感性较低，通常为33-48%，并且低级别的NMIBC中其准确度低于60%。目前，美国食品与药品管理总局（the Food and Drug Administration，FDA）已批准核基质蛋白22（nuclear Matrix Protein22。NMP22）、膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）及ImmunoCyt/uCyt+应用于临床诊断膀胱癌，但容易受到其他因素的影响，假阳性率很高，暂不能取代膀胱镜检查被推荐应用于临床工作。因此，需要新的生物标志物来诊断、监测膀胱尿路上皮癌。microRNA（miRNA，miR）是一种非编码的微小RNA分子，通常由18-24个核苷酸组成，可与信使RNA的C端非翻译区结合，在蛋白表达过程中起到转录后调节作用。文献显示miRNA分子稳定存在组织、血液、尿液等样本中，而血液及尿液中的miRNA分子可作为疾病诊断及预后的非侵入性标志物。本实验将利用这一点探索血清及尿液中miR-21、miR-155分子在膀胱尿路上皮癌的表达情况，寻找特异性强、灵敏度高的生物标志物。血清、尿液中检测蛋白质的含量是临床疾病诊断的经典方法，如PSA诊断前列腺癌。骨桥蛋白（Osteopontin。OPN）及转化生长因子β诱导蛋白（beta transforming growth factor-induced，TGFBI）是两种在膀胱尿路上皮癌中高表达的蛋白，通过阅读文献怀疑其可能在膀胱尿路上皮癌血清、尿液中异常表达。本实验利用酶联免疫吸附测定法（enzyme1inked immunosorbent assay，ELISA）探索OPN及TGFBI在膀胱尿路上皮癌患者血清及尿液中的含量，进一步分析与临床病理学的关系，及对膀胱尿路上皮癌诊断的临床应用价值。
　　目的：⑴解miR-21、miR-155、OPN、TGFBI在不同组别血清、尿液标本中表达的差异性；⑵了解miR-21、miR-155、OPN、TGFBI在膀胱尿路上皮癌不同分期及分级患者血清、尿液标本中表达的差异性；⑶根据血清、尿液中miR-21、miR-155、OPN、TGFBI检测结果，探讨血清及尿液两者单独或联合诊断膀胱尿路上皮癌的敏感性及特异性。
　　方法：①利用RT-PCR的方法分别检测膀胱尿路上皮癌患者、泌尿系良性疾病患者及健康志愿者三组血清、尿液样本中miR-21、miR-155的表达量；②利用双抗体夹心ELISA法分别检测膀胱尿路上皮癌患者、泌尿系良性疾病患者及健康志愿者三组血清、尿液样本中OPN、TGFBI的表达量；③利用受试者工作特征曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）判断血清及尿液中miR-21、miR-155、OPN、TGFBI水平对膀胱尿路上皮癌患者的诊断价值。
　　结果：⑴膀胱尿路上皮癌组血清、尿液miR-21相对表达量均高于良性疾病组、健康对照组（P<0.01），后两者相比也具有统计学意义（P<0.05），血清miR-21相对表达量与患者的肌层浸润、病理级别、有无转移之间相关（P<0.01），而与患者的年龄、性别无关（P>0.05）；尿液miR-21仅与病理级别（P<0.01）、有无转移（P<0.05）之间相关；血清、尿液miR-21对膀胱尿路上皮癌诊断的敏感性分别为90.0%、82.5%，特异性分别为80.0%、76.7%；⑵膀胱尿路上皮癌组血清miR-155相对表达量均高于泌尿系良性疾病组、健康对照组，有统计学差异（P<0.01），后两者相比也具有统计学意义（P<0.05），而尿液中miR-155相对表达量仅高于健康对照组（P<0.05），其他组之间相比无统计学意义（P>0.05）；血清miR-155相对表达量与患者的肌层浸润、有无转移之间相关（P<0.05），而与患者的病理级别、年龄、性别无关（P>0.05）；尿液miR-155仅与患者的有无转移之间相关（P<0.05）；血清miR-155对膀胱尿路上皮癌诊断的敏感性分别为82.5%、62.5%，特异性分别为63.3%、73.3%；⑶膀胱尿路上皮癌组血清、尿液中OPN的表达均显著高于泌尿良性疾病组与健康对照组（P<0.01），后两者之间并无统计学差异（P>0.05），血清OPN表达量与患者的肌层浸润、病理级别、有无转移之间相关（P<0.05），而与患者的年龄、性别无关（P>0.05）；但尿液OPN与临床病理特征无关，血清及尿液OPN对膀胱尿路上皮癌诊断的敏感性分别为90.0%、77.5%，特异性分别为80.0%、80.0%；⑷膀胱尿路上皮癌组血清、尿液中TGFBI的表达显著高于泌尿良性疾病组（P<0.05）与健康对照组（P<0.01），但后两者之间并无统计学差异（P>0.05），血清、尿液TGFBI表达量与患者的肌层浸润、病理级别、有无转移、年龄、性别无关（P>0.05）；血清、尿液TGFBI对膀胱尿路上皮癌诊断的敏感性分别为65.0%、67.5%，特异性分别为70.0%、76.7%。
　　结论：miR-21、miR-155、OPN、TGFBI在膀胱尿路上皮癌患者血清及尿液中均异常高表达，其中miR-21、OPN表达水平更高，血清表达水平比尿液表达较高，可能与膀胱尿路上皮癌组织异常表达有关，对肿瘤的发生、发展及转移产生一定的影响；在某种程度上也与患者的临床病理特征密切相关，提示患者的预后可能较差；其未来可能成为膀胱癌诊断及预后的新生物标志物，甚至为输尿管癌、肾盂癌、血尿症状的尿路上皮癌患者提供一种早期诊断的方法，也可能为治疗膀胱癌提供一个新的、潜在价值的治疗靶点。

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前言

第一章：基因水平检测miR-21与miR-155在膀胱尿路上皮癌中的表达

材料与方法

一、材料

二、方法

三、统计学分析

实验结果

1、血清及尿液miR-21在膀胱尿路上皮癌中的表达

2、血清及尿液miR-155在膀胱尿路上皮癌中的表达

讨论

小结

第二章：蛋白水平检测OPN与TGFBI在膀胱尿路上皮癌中的表达

材料与方法

一、材料

二、方法

三、统计学分析

实验结果

1、血清及尿液OPN在膀胱尿路上皮癌中的表达

2、血清及尿液TGFBI在膀胱尿路上皮癌中的表达

讨论

小结

全文结论

研究展望

图片

参考文献

在学期间的研究成果

致谢

综述:新型内镜成像技术在膀胱癌诊断中的应用进展