β-TCP\HIF-1α缓释复合体对预血管化膜片内皮血管网形成的影响

摘要

目的：本研究欲将不同浓度下的缺氧诱导因子-1α（hypoxia induced factor-1α,HIF-1α）和支架材料β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）复合形成缓释复合体。一方面，研究不同浓度下的β-TCP\HIF-1α缓释复合体对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的招募和迁移作用；另一方面，基于预血管化的细胞膜片技术（cell sheet technology,CST），研究不同浓度下的β-TCP\HIF-1α缓释复合体对内皮血管网形成的作用和影响，以期为优化构建稳定而丰富的三维预血管化网络的工程骨组织提供进一步的理论指导。
　　方法：(1)β-TCP\HIF-1α缓释复合体的构建：将HIF-1α配成浓度为50，100，200mg/L的溶液，无菌过滤分装。将高温高压烘干后的β-TCP支架材料放入HIF-1α溶液中浸泡备用（浸泡3天）；HIF-ELISA试剂盒用于各实验组不同时间点缓释能力的检测。（2）HUVECs迁移实验和预血管化的fBMSCs膜片的构建：胎儿骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenchymal stem cell,fBMSCs)和HUVECs的培养扩增；Transwell迁移实验检测不同浓度梯度下的β-TCP\HIF-1α缓释复合体（0，50，100，200mg/L）和单纯100mg/L的HIF-1α对HUVECs的招募和迁移，经染色处理、显微拍照后软件计数，统计学分析各组差异性。将fBMSCs按9×104个/cm2的密度置于六孔板内进行成膜培养14天（fBMSCs膜片）；HUVECs按5×104个/cm2的密度播种至fBMSCs膜片上进行体外预血管化的构建；大体观、显微镜观察获取膜片特征。（3）β-TCP\HIF-1α缓释复合体对预血管化的fBMSCs膜片内皮血管网形成的影响：将单纯的β-TCP支架组、β-TCP\HIF-1α缓释组（50，100，200mg/L）和100mg/L的单纯HIF-1α因子组，分别放入育有预血管化的fBMSCs膜片的六孔板中，分别在实验的第1，3，7，14天进行CD31免疫荧光染色检测，观察不同实验组中内皮血管网形成的情况。
　　结果：（1）β-TCP\HIF-1α缓释复合体均在第三天缓释浓度达到高峰，后期逐渐降低；21天后，各组的累积释放率均>85％。（2）fBMSCs呈长梭形、HUVECs呈“铺路石”般卵圆形。fBMSCs经14天连续培养可形成一层完整而菲薄的fBMSCs膜片，边缘向内卷曲，可用镊子沿边缘提起。（3）Transwell实验证实HIF-1α具有体外招募和迁移HUVECs的作用，且以100mg/L HIF-1α组作用最为显著（P<0.05）。(4)β-TCP\HIF-1α缓释复合体对预血管化的fBMSCs膜片内皮血管网形成的影响结果显示，200mg/L的β-TCP\HIF-1α缓释复合体组(第7天)和100mg/L的HIF-1α组（第3天）形成的预血管化网络数量最多（P<0.05）。
　　结论：(1)β-TCP\HIF-1α缓释复合体具有一定的缓释效果；(2)HIF-1α对HUVECs具有迁移和招募的作用；(3)HIF-1α影响了内皮细胞在干细胞膜片上血管网的形成。

目录

声明

前言

文献回顾

一、 组织工程预血管化技术的研究

二、 HIF-1α与组织工程技术

三、 β-TCP支架材料在组织工程领域中的应用

实验一 β-TCP\HIF-1α缓释复合体的构建和释放

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 讨论

实验二 预血管化的fBMSCs膜片的构建和HUVECs细胞迁移实验

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

实验三 β-TCP\HIF-1α缓释复合体对预血管化的fBMSCs膜片内皮血管网形成的影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

小结

参考文献

补充材料：不同时间点免疫荧光彩色图片

附录 缩略词表

在学期间的研究成果

致谢

病例汇报