异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞放疗敏感性的影响及机制研究

摘要

目的：
　　研究不同浓度的异甘草素对胶质瘤干细胞放疗敏感性的影响及作用机制，为异甘草素作为放疗增敏剂治疗人脑胶质瘤提供依据。
　　方法：
　　1.使用超低吸附悬浮细胞培养板6孔板，通过无血清条件培养法从SHG44人脑胶质瘤贴壁细胞中提取和纯化胶质瘤干细胞，通过CD133、Nestin联合鉴定悬浮细胞球的干细胞特性，通过Bcl-2鉴定悬浮细胞球的胶质瘤细胞源性；
　　2.运用CCK-8试剂盒检测不同浓度异甘草素和不同剂量X射线的单独和联合运用下胶质瘤干细胞的增殖活性，并在显微镜下观察和记录胶质瘤干细胞悬浮球的成球情况。通过细胞活性和干细胞悬浮球在形态上的抑制情况评估异甘草素的放疗增敏效果；
　　3.运用Western blotting技术检测不同浓度异甘草素作用下Notch1信号通路相关蛋白的表达情况，以Notch1信号通路特异性阻断剂DAPT作为阳性对照。检测异甘草素预处理后胶质瘤干细胞对不同剂量X射线照射后NF-κB和凋亡关键蛋白caspase-3的表达情况，以此探讨异甘草素对胶质瘤干细胞X射线放疗增敏的作用机制。
　　结果：
　　1.无血清条件培养能够有效地提取和纯化人脑胶质瘤干细胞悬浮球，免疫荧光染色CD133和Nestin表达阳性说明悬浮细胞球具有干细胞特性，Bcl-2表达阳性说明悬浮细胞球的肿瘤源性；
　　2.72h后，胶质瘤干细胞的活性被异甘草素所抑（P＜0.05）。异甘草素处理9天后，胶质瘤干细胞的成球能力被抑制,20?M浓度以上的异甘草素能够明显降低胶质瘤干细胞成球的数目和干细胞球的直径（P＜0.01）。在72h内，胶质瘤干细胞的细胞活性并不随X射线的照射剂量的增加而有所改变。在9天的胶质瘤干细胞成球过程中，虽然X射线能够一定程度上减小所形成的悬浮细胞球的直径（P＜0.01），但是，成球的数目并没有因为X射线的照射而下降，表现出X射线的耐受；
　　3.本研究发现10?M的异甘草素虽然直接抑制胶质瘤干细胞生长的作用有限，但在8Gy较高剂量X射存在的情况下，能够增加胶质瘤放疗的敏感性(P＜0.05)，表现为所形成的干细胞球数目下降和直径下降。20?M的异甘草素杀伤胶质瘤干细胞的作用明显，且在4Gy的X射线照射时就有较强的增敏效果，在8Gy的X射线下联合杀伤胶质瘤干细胞的能力进一步提高（P＜0.05）。而40?M以上的异甘草素抑制胶质瘤干细胞增殖的作用较为明显，在联合X射线干预下，主要表现出直接抑制增殖的作用；
　　4.Notch1（Notch1信号通路受体）、RBPJK（Notch1信号通路的转录调节因子）和Hes1（Notch1信号通路的靶基因）的表达在异甘草素组和DAPT组比对照组显著下降（P＜0.05），呈一定的剂量依赖效应。没有X射线干预的情况下，异甘草素组和对照组的P-NF-κB表达量均较低。4Gy的X射线照射后，异甘草素组P-NF-κB比对照组高（P＜0.05），且X射线照射后6h出就开始表达增高，24h进一步升高（P＜0.05）。没有X射线干预的情况下，异甘草素组的cleaved caspase-3表达比对照组高（P＜0.05），随着时间推移没有明显变化。在4Gy的X射线照射后，未加异甘草素组的cleaved caspase-3表达比未放射的对照组明显增高（P＜0.05），但随着时间的推移未见明显变化。而4Gy的X射线照射后，异甘草素预处理组在6h内与未放射组相比，cleaved caspase-3表达没有明显改变，而24h后，cleaved caspase-3表达开始升高（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.人脑胶质瘤干细胞对放疗具有较强的抵抗，20?M异甘草素能够有效抑制胶质瘤干细胞的增殖，同时提高胶质瘤干细胞的放疗敏感性，此浓度的异甘草素作用24h后再用X射线照射，能够抑制胶质瘤干细胞球的形成和减小干细胞球的直径；
　　2.异甘草素能够抑制Noch1信号通路的表达，可能通过改变下游基因的表达增加胶质瘤干细胞的放疗敏感性。在X射线照射后，异甘草素能够上调NF-κB和caspase-3的表达，参与X射线造成的胶质瘤干细胞损伤过程。

目录

声明

前言

中英文缩略词表

第一章 实验一 异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞放疗敏感性的影响

1 材料与方法

1.1 细胞株

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 试剂制备

1.5 细胞培养技术

1.7 实验干预分组

1.8 CCK-8 法检测细胞增殖

1.9 干细胞球直径和数目的测量

1.10 统计分析

2 结果

2.1 胶质瘤干细胞镜下形态和表面分子标记物的鉴定

2.2 异甘草素和X射线对SHG44人脑胶质瘤干细胞活性的影响

2.3 异甘草素和X射线对SHG44人脑胶质瘤干细胞成球能力的影响

2.4 异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞放疗敏感性的影响

3 讨论

第二章 实验二 异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞放疗敏感性的相关通路研究

1 材料与方法

1. 1 细胞株

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 试剂制备

1.5 实验干预分组

1.6 Western blotting分析Noch1、caspase-3和NF-κB的表达

1.7 统计分析

2 结果

2.1 Western blotting分析异甘草素对Notch1信号通路的表达

2.2 Western blotting分析放疗后NF-κB和caspas-3的表达

3 讨论

第三章 结论

1 主要结论

2 研究展望

参考文献

综述:不同联合放化疗方式对儿童髓母细胞瘤疗效的系统评价

在学期间的研究成果

致谢