HCN通道调节背根节神经元P2X受体功能参与神经痛

摘要

背根节（Dorsal root ganglion，DRG）神经元是感觉传入初级神经元，DRG神经元负责接受和整合感觉信息，进而将之传递到脊髓。有研究证实表达于DRG神经元的超级化激活环核苷酸门控（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated，HCN）通道的激活可增高DRG神经元兴奋性，从而促进病理性疼痛的产生。此外，嘌呤能P2X1-6受体在DRG神经元均有表达，尤其是P2X3受体选择性表达于与伤害性感受密切相关的中小型DRG 神经元，研究表明在多种神经病理性疼痛模型中 DRG神经元P2X 受体的激活促进了神经痛的发生、发展。HCN 通道与 P2X 受体均表达于 DRG神经元，且 HCN 通道与 P2X 受体的激活均可促进神经痛的产生，但目前尚不清楚DRG神经元HCN通道与P2X受体之间是否存在相互作用继而参与神经痛的调节。本课题通过制作大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤（chronic constriction injury of sciatic nerve，CCI）模型，结合在体和离体研究，观察：1）背根节HCN通道在神经病理性疼痛中的作用以及对背根节P2X受体表达的影响；2）HCN通道对培养的DRG神经元P2X受体功能的调节作用。本课题从不同角度探讨HCN通道对DRG神经元P2X受体的调节作用，从而参与神经病理性疼痛的调节。 目的： 1. 观察HCN通道在神经病理性疼痛中的作用及其对背根节P2X受体表达的影响。 2. 观察HCN通道对培养的背根节神经元P2X受体功能的调节作用。 方法： 1. 在体实验： 实验分组：7～8w（体质量180～200g）成年雄性SD大鼠40只随机分为5组(n=8)：①sham组(假手术组)；②CCI组(鞘内注射生理盐水)；③~⑤CCI+ZD7288组(鞘内分别注射 10，30，50μg ZD7288)。Sham 组大鼠不予鞘内置管，仅游离坐骨神经，不结扎。其余各组大鼠在鞘内置管5d后行CCI术，术后鞘内给药（1次/d，持续14d）。 行为学检测机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）；免疫印迹 技术 (Western Blot，WB) 检测背根节P2X2、P2X3受体表达。 2. 离体实验： 培养2～3w SD幼鼠DRG神经元分为4组：①ATP组（100μmol/L ATP）；②ZD7288+ATP 组(10，100，1000μmol/L ZD7288 预孵育 10min 后，给予 ATP)；③8-Br-cAMP+ATP组(100μmol/L 8-Br-cAMP预孵育5min后，给予ATP)；④ZD7288+8-Br-cAMP+ATP组(先加100μmol/L ZD7288孵育5min，再加100μmol/L 8-Br-cAMP孵育 5min，最后加 ATP)。采用 MPS-2 多通道快速微量加药系统细胞外给予 ATP （100μmol/L，2s），全细胞膜片钳技术记录DRG神经元ATP诱发的电流。 结果： 1. 大鼠CCI术后1d即形成稳定的机械痛敏，MWT明显缩短（P<0.05）；鞘内注射30μg HCN通道阻滞剂ZD7288可明显延长CCI大鼠MWT（P<0.05）。WB结果说明，CCI大鼠术侧L4-6背根节P2X2受体、P2X3受体表达明显增加（P<0.05）；鞘内给予HCN通道阻滞剂ZD7288可显著降低CCI大鼠背根节P2X2受体、P2X3受体的表达（P<0.05）。 2．培养的背根节神经元可记录到三种ATP内向电流：快速脱敏感反应电流（快IATP），慢速脱敏感反应电流（慢IATP）及先快后慢的混合电流(混合IATP)；HCN通道阻滞剂ZD7288（100μmol/L，10min）可明显抑制DRG神经元快IATP、慢IATP、混合IATP幅值（P<0.05），ZD7288对DRG神经元ATP电流的抑制作用呈现剂量依赖性；8-Br-cAMP (100μmol/L，cAMP的类似物)可增强DRG神经元的ATP电流，ZD7288 （100μmol/L）预孵育10min可显著抑制8-Br-cAMP的效应。 结论： 1. 背根节HCN通道表达增加可促进CCI所致的神经痛的发生与维持，同时可促进CCI大鼠背根节嘌呤能P2X2、P2X3受体的表达。 2. HCN通道的激活可增强背根节神经元P2X受体功能，其机制可能涉及cAMP-PKA信号途径。

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