EGCG类似物对乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的抑制活性评价及分子模拟研究

摘要

阿尔茨海默病（AD）和帕金森氏病（PD）是两种重要的神经性退行疾病。乙酰胆碱酯酶（AChE）和单胺氧化酶（MAO）是治疗阿兹海默病和帕金森氏病的重要靶标。目前临床上治疗两种疾病的药物大多是基于乙酰胆碱酯酶抑制剂和单胺氧化酶抑制剂。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是茶叶中含量最多的儿茶素类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗辐射等多种生理功能。EGCG的一系列类似物很好的改进了EGCG本身存在的脂溶性差、生物利用率低，不稳定等缺点。本文章从EGCG类似物出发，采用多种活性评价方法测定了一系列EGCG类似物对AChE的抑制活性及对MAO的抑制活性及MAO两种亚型MAO-A、MAO-B的选择性。我们采用分子动力学模拟的方法对活性小分子与AChE的作用机理及活性小分子对MAO两种亚型的选择性机理进行了研究，从而为合理的设计AChE及MAO抑制剂提供新思路。 论文的第一章概述了乙酰胆碱酯酶和的结构、活性位点及其催化机制，以及目前AChE抑制剂的研究进展，总结了单胺氧化酶及其抑制剂的研究进展。在此基础上，我们也对EGCG及其类似物生物活性的研究进展进行了系统的阐述。本论文主要是结合生物活性评价和分子模拟手段对EGCG类似物对AChE及MAO的抑制活性及其相互作用机制进行研究。 文章第二章工作主要探究EGCG类似物对AChE的抑制活性及相互作用机制。首先采用Ellman法测定了85个EGCG类似物对AChE的抑制活性，结果表明有3个小分子化合物2159-3796、0908-0110、5586-2478对AChE具有较高的抑制活性，半数抑制浓度（IC50）分别为7.89μM、30.13μM、74.6μM。同时我们采用了微量热泳动（MST）法研究活性最高的化合物2159-3796与AChE的亲和力常数Kd值，测得2159-3796与AChE的Kd值为80.33μM。然后我们采用分子动力学模拟与结合自由能计算的方法来探索2159-3796与AChE的相互作用机制并设计石杉碱甲（Huperzine A，hupA）与乙酰胆碱酯酶的复合物体系作为对照体系。分子动力学模拟的结果表明hupA的头部羰基氧原子能很好的与AChE的Ser200、Ala201、Gly118、Gly119等酯化活性位点的残基间形成的稳定的氢键网络从而来抑制AChE的活性，但是从2159-3796与AChE的结合模式来看由于空间位阻作用2159-3796不能与Ser200、Ala201、Gly118、Gly119很好的形成氢键网络，这个差异决定了两个化合物活性的不同。这为我们后期设计活性更高的AChE的抑制剂提供了依据。 文章第三章工作主要探究了EGCG类似物对MAO的抑制活及对MAO-A、MAO-B的选择性以及活性化合物对MAO-A、MAO-B的选择性机制。首先，我们采用了Holt法对85个EGCG类似物对MAO的抑制活性进行了筛选，结果表明有四个化合物8019-8452、8005-6325、8018-9337、8018-5599对MAO的抑制活性较高，其IC50值均在100μM以下。在此基础上我们采用改进的Holt法研究了四个化合物对MAO-A、MAO-B的选择性，选择性实验结果表明8019-8452小分子表现出了对MAO-B具有较高的选择性其他三个小分子均对MAO-A具有较高的选择性。然后我们采用分子动力学模拟和结合自由能计算的方法研究了活性化合物对MAO-A、MAO-B的选择性机制。分子动力学模拟及结合自由能计算的的研究结果表明Gln215是对MAO-A抑制活性的选择性的关键残基，辅因子FAD是对MAO-B的选择性关键残基。同时积较小的分子更加灵活容易与MAO-B结合口袋底部FAD形成相互作用从而更加倾向于选择性抑制MAO-B。对比四个小分子化合物结构我们发现苯甲酸甲酯骨架是一个对MAO有抑制作用且对MAO-A选择性较高的一个母核结构，这些实验结果对我们后期合理设计活性更高选择性更好的的MAO的抑制剂提供了一定的理论依据。 以上实验结果是借助于生物实验手段结合分子动力学模拟的方法来探究EGCG类似物对AChE和MAO的抑制活性及相互作用机理，实验结果将有助于进一步去发现AChE和MAO的抑制剂，同时也有助于进一步开发和研究EGCG类似物的生物活性。

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Abstract

第一章 绪论

1.1阿尔茨海默病（AD）与帕金森氏病（PD）

1.2乙酰胆碱酯酶及其抑制剂的研究进展

1.2.1乙酰胆碱酯酶结构及其催化位点

1.2.2乙酰胆碱酯酶抑制剂

1.3单胺氧化酶及其抑制剂的研究进展

1.3.1单胺氧化酶

1.3.2单胺氧化酶抑制剂

1.4表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）类似物生物活性研究进展

1.4.1抗氧化活性

1.4.2抗癌活性

1.4.3抗炎活性

1.4.4其它生物活性

1.5分子动力学模拟方法的原理

1.5.1分子对接

1.5.2分子动力学模拟

1.5.3结合自由能计算

1.6本课题研究的内容与研究意义

第二章 EGCG结构类似物对AChE的抑制活性测定及分子动力学模拟研究

2.1研究背景

2.2实验材料

2.2.1实验仪器

2.2.2材料

2.2.3溶液的配制方法

2.3实验方法

2.3.1Ellman法测定 EGCG结构类似物抗乙酰胆碱酯酶活性及IC50值

2.3.2微量热泳动法（MST）测定活性化合物与乙酰胆碱酯酶的亲和常数（Kd）

2.3.3分子对接搭建模拟初始研究体系

2.3.4分子动力学模拟方法

2.3.5结合自由能计算、残基能量分解

2.4结果与讨论

2.4.1EGCG结构类似物抗乙酰胆碱酯酶活性测定及MST测定Kd值

2.4.2模拟体系的稳定性及结构柔性分析

2.4.3氢键占有率及稳定态结合模式

2.4.4结合自由能计算

2.4.5残基能量分解

2.5本章小结

第三章 EGCG结构类似物抑制单胺氧化酶活性测定以及选择性机制的分子动力学模拟研究

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1实验仪器

3.2.2材料

3.2.3溶液的配制方法

3.3实验方法

3.3.1Holt法测定EGCG结构类似物抑制单胺氧化酶活性及选择性

3.3.2模拟体系结构的搭建

3.3.38个复合物体系的分子动力学模拟

3.3.4 结合自由能计算及残基能量分解

3.4实验结果与讨论

3.4.1EGCG结构类似物抗单胺氧化酶活性测定及选择性结果

3.4.2体系的稳定性与柔性的分析

3.4.3体系的稳定态结合模式的分析

3.4.4结合自由能计算及残基能量分解

3.5本章小结

参考文献

在学期间的研究成果

致 谢