Chromatiumvinosum氢酶基因文库的构建和膜结合态氢酶小亚基基因的克隆

摘要

氢酶(Hydrogenase)广泛分布于细菌和真核藻类中,它催化氢分子与质子间的转变,即H<,2>←→ 2H<'+> +2eˉ.微生物氢酶的研究不仅有助于揭示微生物的生理代谢规律,而且对探索利用微生物生产洁净能源氢具有重要意义.根据氢酶在细胞中的位置,可将氢酶分为两类,即可膜结合态氢酶(Membrane-bound hydrogenase,简称MBH)和可溶性氢酶(Soluble hydrogenase,简称SH);前者与细胞膜组分联系在一起,存在于细胞膜中;后者则存在于细胞质和细胞周质中.光合细菌Chromatium vinosum含有两种催化特性各不相同的氢酶:膜结合态氢酶和可溶性氢酶.目前,两种氢酶均已被分离提纯,但其基因及其结构的研究未见报道.该研究构建了含光合细菌C.vinosum氢酶基因的部分文库,并对膜结合态氢酶小亚基基因的克隆进行了研究,为进一步研究C.vinosum氢酶基因打下基础.

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

一、材料

(一)菌株与质粒

(二)主要培养基与试剂

二、主要仪器设备

三、方法

(一)菌体培养

(二)C.vinosum的总DNA的提取

(三)Southern杂交

(四)含氢酶结构基因的部分文库的构建

(五)膜结合态氢酶小亚基基因的克隆

结果与分析

一、C.vinosum的总DNA的提取及电泳分析

二、C.vinosum的总DNA的不完全酶切

三、探针杂交实验

四、含氢酶基因部分文库的构建

1.琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段

2.目的DNA片段与去磷酸化载体的电泳检测

3.含氢酶基因的重组质粒pCV的构建

4.重组质粒pCV的酶切分析

五、膜结合态氢酶小亚基基因的克隆

1.含膜结合态氢酶小亚基基因片段的扩增

2.重组质粒pCVM的构建

3.克隆子的筛选

4.克隆子重组质粒pCVM分析

5.克隆子重组质粒pCVM外源插入片段的序列分析

讨论

参考文献

致谢