RNA干扰抑制KATO-Ⅲ CD133+胃癌细胞CD133基因表达及对其生物学特性的影响

摘要

目的：利用小干扰核糖核酸分子(small interfering RNA， siRNA)抑制KATO-IIICD133+胃癌细胞中CD133基因的表达，探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增殖、侵袭、化疗药物敏感性、克隆球形成及裸鼠体内成瘤能力的影响。
　　方法：针对CD133mRNA设计并合成三段 siRNA（siRNA1， siRNA2和siRNA3），通过对KATO-III胃癌细胞转染和干扰效果的检测，从中筛选出干扰效果最佳的siRNA；利用荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）转染后，通过激光共聚焦显微镜记数检测转染效率；经免疫磁珠分选的方法从KATO-III胃癌细胞中分选出CD133+细胞亚群，并利用上述干扰效果最佳的siRNA对其进行转染，通过RT-PCR和（或）Western-blot方法检测CD133及EMT相关基因蛋白表达水平的变化，分别采用CCK-8法、Transwell侵袭实验、单克隆球形成实验和裸鼠皮下移植瘤实验等检测细胞生物学功能的改变。
　　结果：在KATO-III和KATO-III CD133+两组细胞中，FAM-siRNA的转染效率分别为（72±6）％和（88±8）%，三段siRNA序列中以siRNA3的干扰效果最佳；siRNA3可显著抑制KATO-IIICD133+胃癌细胞中CD133基因的表达，CD133表达被抑制后，KATO-IIICD133+胃癌细胞的增殖活性、侵袭、克隆球形成能力均显著降低，裸鼠皮下接种时移植瘤的重量及体积均明显低于对照组，而细胞对化疗药物5-Fu的敏感性显著增强，同时，EMT相关基因E-cadherin蛋白表达增高，而Snail和N-cadherin的蛋白表达降低。
　　结论：CD133在胃癌细胞的增殖、侵袭、化疗药物抵抗性、克隆球形成和裸鼠体内成瘤等方面具有重要作用，由此提示CD133可能是胃癌干细胞新型标志物，或可成为胃癌生物治疗的新靶点。

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引言

1. CD133 分子及其生物学意义

2. CD133分子与胃癌起始细胞

3. CD133分子的特异性表达与胃癌的发生

4. CD133分子表达与胃癌临床病理特征之间的关系

5. CD133与胃癌患者预后

第一部分胃癌KATO-III细胞CD133基因的siRNA干扰及其效果比较

材料与方法

1. 胃癌细胞株

2. 主要试剂及仪器

3. 实验方法

4 统计学方法

结果

1 荧光标记siRNA转染结果

2 RT-PCR结果

3 Western blot结果

讨论

第二部分RNA干扰抑制KATO-III CD133+胃癌细胞CD133基因表达及对其生物学特性的影响

材料和方法

1. 一般材料

2．主要试剂及仪器

3. 实验方法

4. 肿瘤细胞生物学行为变化的检测

5 统计学方法

结果

1. CD133阳性亚群在分选前后两组细胞中的比例

2．转染效率

3．SiRNA-3在KATO-III CD133+胃癌细胞中干扰效果的检测

4．体外增殖能力检测结果：

5．细胞侵袭能力检测

6．EMT相关基因的蛋白表达

7. 单克隆形成实验

8．化疗药物敏感性检测

9．裸鼠体内成瘤能力

讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录A 论著: 国际外科学杂志. 2012, 39(11):755-799.胃癌KATO-III细胞CD133基因的siRNA干扰及其效果比较

附录B综述: 国际外科学杂志. 2012, 39(1):56-59.干细胞表面标志物CD133与胃癌的研究进展

附录C：攻读硕士学位期间发表的学术论文