免疫捕捉PCR技术在严重传染病快速检测中的应用

摘要

本文探讨ic-PCR 法在四种严重传染病病原：霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、SARS 冠状病毒和流感病毒检测中的应用。1. 三种免疫捕捉法：微孔板、200ulPCR 管和免疫磁珠，均可从环境样品和人体样品中特异捕捉霍乱弧菌、大肠埃希氏菌O157、SARS 冠状病毒和流感病毒，较传统的分离培养方法可节省大量时间。免疫磁珠法因可处理的样品量大，反应动力学特性更佳，是最合适的免疫捕捉方法。2. 细菌的检测：在O1、O139 群霍乱弧菌的群特异性抗原基因和肠毒素基因上，设计3 对引物进行多重PCR，一次PCR 反应即可检测出霍乱弧菌，区分血清群别及是否为流行毒株。PCR 扩增序列与预计序列完全一致，检测限低于100cfu/ml；根据大肠埃希氏菌O157的rfb 基因设计的巢式PCR 引物扩增，可特异扩增497bp 片段，序列与S83460 完全一致，检测限约102cfu/ml，免疫磁珠法略高于200ulPCR 管法。3. SARS 冠状病毒的检测：微孔板法捕捉的病毒颗粒，经热裂解后荧光RT-PCR 检测SARS 病毒RNA 的保守序列片段，临床标本检测未出现假阳性结果，避免了直接提取标本总RNA 进行荧光RT-PCR 检测时产生假阳性的干扰，检测限101copies，灵敏度比推荐用的荧光RT-PCR 试剂盒标称值提高了10 倍，在临床病人的诊断上具有重要的参考意义。4. 流感病毒的检测：流感病毒对人类危害最大的主要是A/H1和A/H3 两型。200ul PCR 管结合RT-PCR 扩增NP 基因，检测限约为102 个病毒粒子，含漱液检测未出现非特异扩增，检出率比细胞培养法提高约50﹪。但以免疫磁珠法结合RT-PCR 扩增，灵敏度反而较microtube 法低100 倍，这可能与免疫磁珠的反应活性及RNP 颗粒的完整性有关。