蛋白微阵列免疫测定在致病菌检测中的方法研究及应用

摘要

本论文由四个部分组成：1.研究概况和目标；2.抗体蛋白的提纯和标记；3.蛋白微阵列芯片在细菌免疫检测中的应用研究；4.蛋白微阵列芯片技术用于2005年渤海海区4种弧菌及大肠杆菌分布特征的研究。 第一章主要介绍研究概况和目标。综述了生物芯片包括基因芯片和蛋白芯片的原理、产生和发展，蛋白质微阵列芯片的制备及一般分析过程及主要的分析仪器，介绍了蛋白质微阵列技术的国内外研究现状；水体中细菌检测的传统方法、免疫学方法和生物芯片方法(包括基因芯片和蛋白芯片)的研究现状等。在此基础上提出了本论文的主要研究方向，即应用蛋白质微阵列技术实现对细菌的定量检测，并进一步将此项技术运用于渤海海区海洋致病菌的检测。 第二章主要研究了抗体蛋白的提纯和标记。提纯结果表明盐析法—蛋白A亲和层析法具有很好分离提纯效果；通过分别用FITC、RBITC和Cy3三种荧光染料标记抗体蛋白，研究标记后抗体蛋白的紫外和荧光光谱等特性，说明Cy3作为蛋白质荧光标记物更优于FITC和RBITC，具有摩尔吸光系数高、水溶性好、易于标记等优点，作为蛋白芯片标记物具有效率高、荧光强度大、检测灵敏度高、实用的特点。 第三章主要建立了一种用于水体中细菌检测定量(以副溶血弧菌、河弧菌和大肠杆菌3种细菌作为研究对象)的蛋白微阵列免疫分析法。以Cy3标记抗体蛋白为探针，蛋白芯片为载体，对孵育反应的IgG(immunoglobulinG，抗体蛋白)浓度、反应时间、温度、免疫检测方式等条件进行了优化，结果表明：当IgG浓度为0.1mg/ml，在37℃下孵育60min，采用芯片免疫直接法检测可以获得理想的检测效果；在优化条件下采用芯片免疫直接法检测，副溶血弧菌、河弧菌和大肠杆菌的检测限分别为9.9×104个/ml、9.3×104个/ml和3.9×105个/ml；将本方法与ELISA进行了比较，结果表明，本方法具有快速、操作便捷、高通量检测、绝对灵敏度高的特点；将本方法应用于海水样中这3种致病菌定量检测表明本方法具有很好的快速、准确的特性。 第四章主要介绍了在2005年渤海春季和夏季两个航次中的使用免疫蛋白芯片检测技术对渤海自然海区海水中的4种海洋致病弧菌和大肠杆菌的存在分布进行了初步研究，其中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌和大肠杆菌。由于实际环境中的细菌浓度水平不高，所以使用蛋白芯片检测前需要预富集。研究结果表明，1)所检测的5种细菌总菌数在夏季的数量要高于春季，其平均菌数分别为2.48×105个/L和3.05×104个/L；2)5种细菌的数量在夏季比春季都有一定增加，特别河弧菌数量是春季的15.41倍；3)在夏季，渤海湾5种病原菌总数量分别是辽东湾，莱州湾和渤海中部的4.87，10.52和7.15倍；4)沿岸地区的菌数为渤海中部的4.68倍，表明所检测的5种细菌的数量由沿岸向渤海海区中部递减的趋势。在国内对渤海海区大范围的致病菌存在分布的监测研究尚属首次，本研究结果表明免疫蛋白芯片检测技术用于海洋细菌的常规监测具有很大的发展空间。 本工作的主要创新点在于：通过对蛋白质微阵列方法的研究，建立了一种用于水体中细菌检测定量的蛋白微阵列免疫直接分析法，与传统的免疫学检测相比，本方法具快速、操作便捷、高通量检测的特点；首次将本方法应用于渤海海区5种致病菌的存在分布研究，研究结果也表明了蛋白质微阵列技术用于细菌检测具有非常广阔的发展前途和应用前景。

目录

文摘

英文文摘

第一章研究概况和目标

1.1生物芯片

1.1.1生物芯片的原理与发展

1.1.2基因芯片技术

1.1.3蛋白芯片技术

1.1.4生物芯片荧光分析法设备

1.2水体中的细菌学检测

1.2.1水体细菌学检测的传统方法

1.2.2细菌的免疫学测定

1.2.3基因芯片细菌检测

1.2.4蛋白微阵列细菌检测

1.3本工作设想

参考文献

第二章抗体蛋白的提纯和标记

2.1方法原理

2.1.1 IgG分离提纯方法

2.1.2抗体蛋白质的荧光标记和分离

2.1.3纯化抗体浓度和标记抗体浓度和标记比的测定

2.2实验部分

2.2.1仪器设备

2.2.2试剂

2.2.3抗体提纯

2.2.4抗体的荧光标记

2.2.5紫外分光光度法测定提纯蛋白浓度和标记后蛋白的浓度和标记比

2.3结果与讨论

2.3.1盐析法-蛋白A亲和层析法提纯抗体蛋白

2.3.2三种荧光染料吸收光谱与荧光光谱

2.3.3三种染料对蛋白质的标记

2.4小结

参考文献

第三章蛋白微阵列芯片在细菌免疫检测中的方法研究

3.1前言

3.2方法原理

3.2.1芯片的表面修饰

3.2.2常见的3种荧光免疫分析方法的特点和使用范围

3.2.3芯片非特异性染色原理及本实验采取的措施

3.3实验部分

3.3.1仪器设备

3.3.2试剂

3.3.3兔抗的提纯和Cy3标记

3.3.4醛基修饰玻片的制备

3.3.5微阵列芯片分析实验检测细菌

3.4结果和讨论

3.4.1芯片上细菌抗原的固定

3.4.2芯片免疫反应IgG浓度、时间和温度条件的优化

3.4.3荧光显微镜研究芯片免疫分析方法

3.4.4激光共聚焦检测研究芯片免疫直接法和间接法

3.4.5激光共聚焦图像研究芯片夹心法

3.4.6芯片免疫直接法检测3种常见海洋致病菌

3.4.7抗体特异性的考察

3.4.8免疫芯片直接法与酶联免疫法(ELISA)的比较

3.4.9免疫芯片直接法分析实际海水样品

3.5小结与展望

参考文献

第四章蛋白微阵列芯片技术用于2005年春夏季节渤海海区4种弧菌及大肠杆菌分布特征的研究

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1样品采集和预处理

4.2.2海洋致病菌的蛋白芯片荧光直接法检测

4.3结果

4.3.1季节变动状况

4.3.2渤海地区5种细菌的分布特征

4.3.3春夏两个季节的5种海洋致病菌数量比较

4.4讨论

4.5小结与展望

参考文献

附录：攻读硕士期间已发表和待发表的论文及成果

致谢