虾蟹混养池细菌多样性的研究

摘要

本论文针对当前海水养殖环境微生物作用研究的热点问题，首次将PCR-DGGE技术引入到我国虾蟹混养池微生物生态学的研究领域，优化了虾蟹混养池沉积物的总DNA提取方法及DGGE分离方法，并结合传统的平板培养方法对泉州湾滩涂虾蟹混养池的沉积物及水体的理化因子、细菌数量及细菌多样性随养殖时间推移的动态变化及空间上的变化进行了研究，同时对沉积物细菌总DNA的DGGE图谱的16Sr DNA片段的主要亮带进行克隆、测序。研究取得以下主要结果： 1.沉积物总DNA提取的方法：先以TENP缓冲液去除沉积物中的腐殖酸，继之以溶菌酶-SDS温和裂解，其提取效率达90％以上，所获DNA产量达2-20μg/g湿重沉积物，片段大小均在23 kb左右，不经纯化即可直接进行PCR扩增和限制性酶切等分子生物学操作。 2.DGGE分离方法：采用对大多细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对GC-341F和517R，以普通Taq酶进行PCR扩增，将长约200bp的扩增产物使用变性剂浓度梯度为40％到60％的8％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离，最后对电泳谱图进行分析，得出其中细菌多样性的信息。 3.检测池在整个养殖期，理化因子都在对虾养殖耐受范围内，呈波动状态，不存在明显的规律；沉积物中的总菌数(DAPI计数)随着养殖时间的推移呈波动状态、总体呈上升趋势，与总有机碳呈明显的相关性；水体及沉积物中的异养菌数、弧菌总数都呈波动状态、总体呈下降趋势，与水温、溶解氧、总氮、磷酸盐等环境因子相关性不明显。 4.新旧池水体及沉积环境都存在丰富的细菌多样性，但相对而言，放苗前和养成前期均较低，从养成中期开始逐渐升高，养成末期又有所下降；其细菌群落结构在整个养殖期处于动荡变化状态；沉积物细菌多样性较水体的丰富且稳定性较好；DGGE法研究虾池的群落结构变化与可培养异养菌数的变化之间没有明显的相关性。 5.对沉积物DGGE图谱上的特征条带进行回收测序，测序结果为：γ-变形杆菌亚群、δ-变形菌亚群、拟杆菌群、厚壁菌群、放线菌群、绿弯菌群和一些未知菌群，这些菌群可能在养殖过程的物质和能量疏通方面起了重要的作用。 6.对虾蟹混养池和水源区进行异养菌数及细菌多样性的评价，结果表明，水源区的水体及沉积物异养总菌数都是高于新旧虾蟹养殖池；新池的水体及沉积物的细菌多样性都是高于水源区、高于旧池。这种差异可能与代谢调控有关系。

目录

声明

摘要

1前言

1.1对虾养殖的现状

1.2养殖生态系统脆弱性的根源

1.2.1养殖生态环境的特殊性

1.2.2养殖生态环境中的物质循环

1.2.3养殖生态环境的污染

1.2.4养殖生态环境污染的结果

1.3微生物在养殖生态系统中的地位和作用

1.4养殖生态环境微生物多样性研究的意义及现状

1.5微生物多样性研究方法的发展

1.5.1微生物纯培养法

1.5.2分子生态学方法

1.6变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)简介

1.6.1DGGE的基本原理

1.6.2 DGGE在微生物生态学研究中的应用

1.6.3 DGGE技术自身存在的缺陷

1.7.4 DGGE在微生物生态学中的应用前景

1.7本论文的研究思路、目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.2基本方法

3.结果与分析

3.1虾蟹混养池沉积物总DNA提取方法的优化

3.1.1不同试验样品总DNA的提取

3.1.2沉积物DNA的提取效率

3.1.3腐殖酸等杂质的去除

3.1.4限制性酶切

3.1.5 16S rDNA的PCR扩增

3.2 DGGE技术方法的优化

3.2.1引物的选择

3.2.2 DNA聚合酶的选择

3.2.3 PCR产物纯化前后在DGGE图谱上的差异

3.2.4上样量的选择

3.2.5电压及电泳时间的选择

3.2.6变性梯度的选择

3.2.7染色方法的选择

3.3虾蟹混养池的环境因子分析

3.3.1虾蟹混养池的基本概况

3.3.2理化因子动态变化

3.3.3水体及沉积物细菌总数

3.3.4细菌数量分布与生态环境因子的关系

3.4虾蟹养殖过程水体及沉积物细菌多样性的变化分析

3.4.1水体细菌多样性的变化分析

3.4.2沉积物细菌遗传多样性的变化分析

3.4.3水体与沉积物细菌多样性比较

3.4.4细菌多样性与环境因子的关系

3.4.5细菌多样性与异养总菌数的关系

3.4.6沉积物优势种群的分析

3.5虾蟹混养池及水源区的水体、沉积物细菌多样性的评价

3.5.1理化因子的测定

3.5.2异养菌数及弧菌数的检测

3.5.3细菌多样性的差异

3.5.4细菌多样性与环境因子的关系

3.5.5细菌群落组成与异养菌数的关系

4讨论

4.1虾蟹混养池沉积物微生物总DNA提取方法的确立

4.2变性梯度凝胶电泳方法的确立

4.3虾蟹混养池理化因子的动态变化

4.4虾蟹混养池细菌数量的动态变化

4.5荧光计数法与平板计数法所得结果的差异分析

4.6新旧池沉积物细菌数量的比较

4.7虾蟹混养池细菌动态变化与环境因子的关系

4.8虾蟹混养池细菌群落结构的动态变化

4.9虾蟹混养池表层沉积物中的优势种群分析

4.10虾蟹混养池与水源区细菌多样性的差异分析

4.11关于DGGE法研究细菌多样性的几点认识

5结论与展望

参考文献

致 谢

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