重组大肠杆菌生产β-葡聚糖酶发酵工艺优化研究

摘要

本文对利用胞外分泌型重组大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109-pLF3发酵生产β-1，3-1，4-葡聚糖酶的培养基及发酵工艺优化进行了系统的研究。首先对菌种产酶培养基中的碳、氮源进行了优化，结果表明甘油为最佳碳源，酵母粉和硝酸钠为最佳混合氮源，且氮源对产酶影响更大。采用Plackett-Burman设计法筛选出了培养基中影响产酶的重要因素为酵母粉，确定出最佳培养基组成为：酵母粉12g·L-1、甘油6g·L-1、NaCl10g-L-1、NaNO37.21g·L-1、KH2PO42.4g·L-1、K2HPO412.5g·L-1。对摇瓶中培养条件的优化采用单因子实验法，研究了温度、培养基初始PH、转速、装液量、种龄和种量等对工程菌生长和产酶的影响，确定了最佳培养条件为：温度39℃、摇床转速150r·min-1、培养基装量20mL/250mL、培养基初始pH自然值、种子培养时间16h、接种量1％。采用优化后的培养基及培养条件，发酵30h酶活力达最大值481.41U·mL-1，为初始条件下的23.1倍，单位菌体产酶能力达到了348.14U，约为初始时的83.3倍。摇瓶中对数生长期流加被证明是非常有效的，以补加高浓度有机、无机混合氮源对产酶影响最大，且适当提高流加量促进产酶效果更明显，酶活力可达628.3U·mL-1。采用5L自动发酵罐，首先对β-葡聚糖酶间歇培养中搅拌速度和通气量进行了研究，发现二者对菌体生长和产酶都存在一定的影响，且搅拌速度400r·min-1和通气量2L·min-1的条件对酶的合成最有利。发酵罐中菌体生长情况比较复杂，出现了二次的现象，针对菌体的生长特点分别采取了对数期流加和稳定期流加两种流加策略。结果显示，稳定期流加对菌体生长及产酶都有明显的促进作用，酶活力比间歇培养提高了将近一倍。对β-葡聚糖酶粗酶液性质的研究实验表明，β-葡聚糖酶粗酶液的最适反应温度为50℃，耐热温度也为50℃。该β-葡聚糖酶的最适反应pH为6，在pH为5～7的较窄范围内较稳定，而且耐碱性相对较强。金属离子对β-葡聚糖酶活性的负面影响主要来自Fe3+和Cu2+，Zn2+和Mn2+在不同浓度条件下对β-葡聚糖酶有不同的作用，在低浓度下表现出激活作用，Ca2+、Mg2+、Fe2+和Co2+在1.0～5.0mM浓度范围内对β-葡聚糖酶均有激活作用。

目录

文摘

英文文摘

厦门大学学位论文原创性声明及著作权使用声明

第一章绪论

引言

1.1β-葡聚糖和β-葡聚糖酶

1.1.1β-葡聚糖

1.1.2β-葡聚糖酶的分类及作用方式

1.1.3β-葡聚糖酶的来源

1.2β-葡聚糖酶的现状及应用

1.2.1现状

1.2.2应用

1.3β-葡聚糖酶的生产

1.3.1酶的生产方法

1.3.2生物合成法生产β-葡聚糖酶

1.3.3生物合成法生产β-葡聚糖酶的影响因素

1.3.4外切-β-葡聚糖酶的生产

1.3.5内切-β-葡聚糖酶的生产

1.3.6基因工程育种

1.4课题提出的依据及研究目的

1.4.1依据

1.4.2研究目的

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种及其保藏

2.1.2主要原料及试剂

2.1.3培养基

2.2主要仪器设备

2.3培养条件

2.3.1种子培养条件

2.3.2摇瓶发酵初始条件

2.3.3摇瓶发酵优化条件

2.3.4发酵罐初始培养条件

2.4实验方法

2.4.1菌体生长量测定

2.4.2β-葡聚糖酶活性测定

2.4.3残糖量测定

2.4.4蛋白质含量测定

第三章发酵产酶培养基的优化

3.1种龄及发酵产酶周期的确定

3.1.1种龄的确定

3.1.2发酵产酶周期的确定

3.2培养基优化

3.2.1碳、氮源优化

3.2.2添加吐温80对菌体生长及产酶的影响

3.2.3培养基配方的优化

3.3培养基优化前后菌体生长及产酶的比较

3.4本章小结

第四章摇瓶发酵产酶条件的优化

4.1温度的影响

4.2培养基初始pH值的影响

4.3接种量的影响

4.4种龄的影响

4.5溶氧量的影响

4.5.1培养基装量的影响

4.5.2摇床转速的影响

4.6发酶周期的影响

4.7培养条件优化前后菌体生长及产酶的比较

4.8本章小结

第五章摇瓶流加培养

5.1流加阶段的选择

5.2流加物质的影响

5.3氮源流加量的影响

5.4补料速度的影响

5.5本章小结

第六章发酵罐培养

6.1 5L发酵罐培养

6.1.1间歇培养

6.1.2流加培养

6.2 3L发酵罐培养

6.2.1间歇培养

6.2.2对数期流加培养

6.3本章小结

第七章β-葡聚糖酶粗酶液的性质分析

7.1主要原料及试剂

7.2结果与分析

7.2.1温度对粗酶液性质的影响

7.2.2pH对粗酶液性质的影响

7.2.3金属离子对粗酶液性质的影响

7.3本章小结

第八章结论与展望

8.1结论

8.2存在问题及展望

参考文献

附录

致谢