Midkine新亚型和相应RNA新剪切形式的发现：它在小鼠胚胎发育与肿瘤生成过程中表达与功能初探

摘要

Midkine(MK)是一类肝素结合生长/分化因子，是小鼠胚胎发育中视黄酸诱导的早期表达基因之一。迄今研究表明，MK具有较广泛的生物学功能，如它参与了生长、分化、血管生成和细胞凋亡等过程。它不仅与胚胎发育有关，与癌变、肿瘤生成也密切相关。 为了研究MK在组织分化和器官生成中的表达情况和潜在的功能，(一)我们首先通过免疫组化方法研究MK在空间上的表达行为。结果我们首次发现，在组织器官(胰脏和肾脏等)的发育分化过程中，(1)MK主要富集于上皮(epithelial)—间充质(mesenchymal)界面处；(2)尤其是在接近新生血管的界面处；(3)而且，MK的表达随细胞的分化/成熟度的增加而降低；并且，它的表达在未分化上皮干细胞的基膜处维持最高，而随着细胞的分化和成熟而降低。这些揭示了它在组织器官发育分化过程中普遍存在的上皮—间充质相互作用，在最近发现的新生血管对组织分化的诱导作用的信号传导，以及对调节干细胞的自我更新/增殖与分化的平衡等方面都发挥一定的作用。 (二)然后，我们用RT-PCR的方法检测MK在时间上的表达行为。为了提高PCR反应的灵敏度和专一性，我们采用了巢式(Nested)、直降(Touchdown)PCR的方法。结果，(1)我们不仅发现MK的表达随胚胎发育而受调制，即在E6.5至E15.5期间有明显表达，而在此区间前后，则表达甚微；(2)我们还首次检测到，MK的截短型(truncated，tMK)在正常胚胎发育过程中的某些器官(如胰脏和肝脏)发育的特定阶段(如E11.5至E12.5)有明显表达。在此之前，tMK一般只在肿瘤和癌症组织中被检测到，并一直被普遍认为，tMK参与诱变癌症/肿瘤，而作为检测癌症/肿瘤的一种标志。因此，我们的发现，为研究MK在肿瘤生成和癌变中的机理，提供了新视野；(3)随后，用同样的技术，我们又发现了在小鼠正常器官发育的特定阶段(如E11.5至E12.5的胰脏和肝脏)，MK的另外两种新截短型，分别称tMK-B和tMK-C。它们在E8.5和E14.5及其前后均没有表达。这表明它们在器官形成中具有某种独特的功能；(4)分析表明，这三种截短型，首次在小鼠中检测到；(5)并且，虽然tMK-C相应的截短型(缺失一个完整的外显子)在人体病变组织中的表达已有报道，但tMK-A和tMK-B则是全新的截短型；(6)有趣的是，它们(tMK-A，tMK-B和tMK-C)的剪切位点序列具有特异性，3'和5'端剪切位点碱基序列相同，即tMK-A的3'和5'端剪切位点序列为-AGTG-、tMK-B为-GACC-、tMK-C则为-AGCC-。这是首次发现具有序列专一性的mRNA剪切模式。从基因结构上看，tMK-A、tMK-B缺失了外显子Ⅲ和Ⅳ的部分，tMK-C缺失了外显子Ⅳ。可见，这里很可能存在着一种新的mRNA剪接加工的分子机制。总结这方面的表达研究，我们不仅验证了MK在正常胚胎发育中的调控表达，而且首次发现了截短型MK在正常发育中的特异表达。这些对揭示MK在发育分化中的功能和分子机理，提供了新思路。综合实验室研究，在人类癌变组织中MK表达的新发现(MK也存在三种截短型)，这些研究将有利于认清MK在肿瘤生成和癌变过程中的作用和潜在分子机制(如可能是由于新的剪切方式的突变而造成癌变等)。 (三)为了进一步探究MK功能的分子机理，我们克隆了MK及其截短型，并通过表达载体PET28a在BL21菌中表达，以研究MK及各种截短型的分子活性。初始结果表明，MK及其截短型，对成纤维肿瘤细胞的迁移(migration)，形态发生和增殖有一定作用。这些结果为进一步更广泛(如其它细胞系、条件等)、更深入(分子机理和细胞行为)的研究奠定了基础。

目录

文摘

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厦门大学学位论文原创性声明及著作权使用声明

前言

一.MK分子生物学特性与蛋白结构

二.MK的生物学功能

1.神经营养活性

2.修复受损组织和促进血管生成

3.促纤溶活性

4.促生长分化功能

5.其他

三.MK的分布

四.MK与疾病的关系

1.MK与肿瘤/癌变的关系

2.MK与老年痴呆(Alzheimer's Disease)

3.MK 与HIV

4.其他

五.截短型(truncated)MK发现及生物学特性

六.展望

材料与方法

一.生物材料与主要实验仪器、试剂

1.生物材料

2.主要仪器

3.主要试剂来源

二.主要试剂配制

1.LB培养基配制

2.1mol/L CaCl2贮存液配制

3.质粒抽提/裂解缓冲液配制

4.0.1mol/L IPTG(异丙基—β—D—硫代半乳糖苷)配制

5.考马司亮蓝染液配制

6.2×SDS凝胶加样缓冲液配制

7.15％SDS聚丙烯酰胺凝胶配制

8.磷酸缓冲溶液(PBS)配制

三.实验方法

1.解剖

2.免疫组化

3.RNA提取

4.RT-PCR

5.PCR产物回收

6.克隆转化

7.质粒提取

8.酶切鉴定并测序

9.表达载体的构建

10.诱导表达

11.表达蛋白提取

12.蛋白活性测定

实验结果及分析

一.MK小鼠胚胎发育中的表达

二.截短型MK特异表达于正常器官形成中某个时期

三.新截短型MK的克隆和测序分析

四.MK在组织分化和干细胞自我更新与分化中的功能

五.MK在干细胞中的表达

六.tMK-B和tMK-C的发现

七.PET-tMK及PET-MK重组载体的构建及诱导表达示意图

八.功能鉴定

讨论

一.MK的表达与分布

二.MK及截短型MK(tMK)在肿瘤中的表达

三.小鼠MK及截短型MK

四.新的剪接形式

五.功能

结语

参考文献：

附录一在学期间发表论文及在NCBI geneband中发表的cDNA文库

附录二所用载体图谱

致谢