海洋石油降解菌的分离鉴定及其在海洋石油污染生物修复中的应用研究

摘要

由于全球性广泛的石油生产、运输、使用和处置，在许多环境特别是海洋环境中，石油污染已经成为一个普遍而严重的问题。目前，我国沿海地区海水含油量已超过国家规定的海水水质标准2～8倍。本文以原油或柴油为唯一碳源从厦门近海表层海水样品中通过富集筛选得到了2组降解菌群。从柴油富集物中分离得到了2株细菌，经16SrDNA鉴定分别属于假单胞菌属(Pseudomonaspseudoalcaligenes，97％)和食烷菌属(Alcanivoraxdieselolei，99％)。从原油富集物中分离得到了7株细菌，经16SrDNA鉴定，分别属于不动杆菌属(Acinetobacterradioresistens，99％)、生丝单孢菌属(Hyphomonasjohnsonii，99％)、食烷菌属(Alcanivoraxborkumensis，99％)、根瘤菌属(Mesorhizobiumloti，96％)、赤细菌属(Erythrobacterflavus，93.58％)、玫瑰杆菌属(Roseobactergallaeciensis，95.81％)和希瓦氏菌属(Shewanellaaquimarina，99％)。其中，GY-2和Y-2与赤细菌属和玫瑰杆菌属已报到的其它种的16SrDNA同源性最高，但也仅为93.58％和95.81％。GY-2能产H2S；能利用萘、蒽、菲等多环芳烃作为生长的唯一碳源；对青霉素敏感；除含有赤细菌属的主要脂肪酸C18:1ω7c外还含有脂肪酸C16:0；G+C含量为62.0～62.2％，实验结果表明GY-2是属于赤细菌属的一个新种，命名为芳烃赤细菌(Erythrobacteraromatiphilus)。Y-2能在37℃生长；有将硝酸盐还原成亚硝酸盐的能力；除含有玫瑰杆菌属共有的主要脂肪酸C18:1外，还含有C18:0和C16:0两种主要脂肪酸；G+C含量为62.4％，实验结果表明Y-2是属于玫瑰杆菌属的一个新种，命名为厦门玫瑰杆菌(Roseobacterxiamengensis)。 通过对分离得到的单菌的功能进行研究，选取了实验室保藏的6株柴油降解菌构建了一个柴油降解菌群。通过柴油降解率的测定、残油组分的GC-MS检测分析和菌群结构变化的PCR-DGGE检测对该混合菌群进行了优化，最终得到一组含有2HE-4、PN3-2和B-5三株细菌的柴油降解菌群，其对柴油的降解率为55.9％。此外，选取了AS-3、Y-1、AY-2、Y-2、GY-2、OY-1、AS-5、PN3-2、3C-9和B-5十株细菌，构建了组合1(AS-3、Y-1、AY-2、Y-2、GY-2、OY-1、AS-5)和组合2(AS-3、Y-1、AY-2、Y-2、PN3-2、3C-9、B-5)两个原油降解菌群，将这两个菌群与天然富集菌群的原油降解率进行比较，并检测了天然富集菌群在降解不同底物时的菌群结构变化，通过综合分析优化出一个含有OY-1、B-5和GY-2三株细菌的原油降解菌群。 将优化得到的原油降解菌群应用于户外水池模拟石油污染的生物修复，记录七天内的表观变化过程，发现在3天内即表现出明显的消除作用。利用GC-MS检测七天后空白对照水池和添加菌群的水池的残油丰度，结果表明应用降解菌群的水池残油含量明显少于对照水池，取得了很好的修复效果。

目录

文摘

英文文摘

厦门大学学位论文原创性声明及文著作权使用声明

1前言

1.1海洋石油污染的生物修复

1.1.1海洋石油污染的现状与危害

1.1.2石油在海洋环境中的降解途径及归宿

1.1.3降解石油的微生物

1.1.4影响海洋石油烃微生物降解的关键因素

1.1.5生物修复在海洋石油污染治理中的应用

1.2细菌的鉴定分类

1.2.1脂肪酸分析

1.2.2醌在细菌分类中的作用

1.2.3DNA碱基组成(G+C mol%)分析在分类中的应用

1.2.4DNA-DNA相关性

1.2.5rRNA序列分析

1.3本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.2基本方法

2.3海洋原油降解菌的富集、分离和鉴定

2.3.1培养基

2.3.2原油降解菌的富集、筛选

2.3.3PCR-DGGE确定混合菌群中的优势菌

2.3.416SRDNA的鉴定与系统发育树的构建

2.4原油降解细菌新种的分类

2.4.1表型分析

2.4.2细菌叶绿素a及类胡萝卜素的检测

2.4.3反相高效液相色谱法测定基因组DNA中的G+Cmol%含量

2.4.4气相色谱-质谱法测定细菌中脂肪酸

2.4.5Biolog细菌鉴定法

2.5柴油及原油降解菌群的构建与优化

2.5.1单菌及混合菌群降解能力的测定

2.5.2柴油混合菌群结构变化的监测

2.5.3原油混合菌群在不同底物中的菌群结构变化

2.6户外水池模拟沙滩原油污染修复实验

3结果与讨论

3.1海洋石油及柴油降解菌的富集、分离和鉴定

3.1.1结果与分析

3.1.2讨论

3.2两种原油降解菌新种芳烃赤细菌(Erythrobacter aromatiphilus)及厦门玫瑰杆菌(Roseobacter xiamengensis)的鉴定

3.2.1结果与分析

3.2.2讨论

3.3柴油及原油降解菌群的构建

3.3.1结果与分析

3.3.2混合菌群的优化

3.3.3讨论

3.4模拟沙滩原油污染生物修复实验

3.4.1结果与分析

3.4.2讨论

小结和展望

参考文献

附录1：Biolog gn碳源表

附录2：攻读硕士学位期间发表和待发表的论文

致谢