深海重金属抗性菌的分离、鉴定以及菌株Brevibacterium sanguinis NCD-5铬（Ⅵ）还原机制的初探

摘要

海洋微生物 种类包括几乎所有的微生物类型，这些微生物因生存在海洋高盐、高压、低温、低营养和无光照等这种极端环境条件下而具有特殊的生理性状和遗传背景，具有许多特殊功能，如耐盐性、耐低温、耐高温、耐高压和高渗透性、固氮、硝酸还原、抗重金属等，现在对深海重金属抗性细菌的筛选研究多集中在热液口，而对其它深海环境中的重金属抗性微生物研究较少。本文从太平洋深海多金属结核区进行了重金属抗性菌筛选和分离鉴定，并对其对重金属的抗性机制或解毒机制开展了初步的研究。 通过两次不同浓度的镉(Ⅱ)、汞(Ⅱ)、铅(Ⅱ)、锰(Ⅱ)、钴(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)、镍(Ⅱ)、铜(Ⅱ)8种重金属富集，从东、西太平洋和南海底泥中共分离得到280株细菌，分别属于16属33种，16SrDNA测序显示，细菌分别属于Bacilluspumilus、Bacilluscereus、Bacillusfirmus、Bacillusmegaterium、Bacillusmycroides、Bacillusmojavensis、Bacilluscibi、Bacillussphaericus、Bacillusfusiformis、Bacillushwajinpoensis、Bacillusvietnamensis、Advenellaincenata、Alcanivoraxdieselolei、Alcaligenesfaecalis、Arthrobacteroxidans、Brachybacteriumparaconglomeratum、Brevibacteriumaureum、Brevibacteriumsanguinis、Citricoccusalkalitolerans、Exiguobacteriumaurantiacum、Halomonasmeridiana、Halomonasvenusta、Kocuriapalustris、Kocuriaerythromyxa、Microbacteriumoxydans、Microbacteriumoleovorans、Paracoccusmarcusii、Planococcusmaritirnus、Staphylococcussaprophyticus、Staphylococcusepidermidis、Virgibacillusdokdonensis、Virgibacilluspictruae。分别属于Actinobacteria、Firmicutes、α-，β-，γ-Proteobacteria类群，其中有几株细菌是首次发现存在于深海并具有重金属抗性的，如东太平洋样品分离得到的菌株AdvenellaincenataCr12以及南海样品分离得到的菌株BrevibacteriumsanguinisNCD-5。分离得到芽孢杆菌12种231株，芽孢杆菌为出现频率最高的菌，占总菌数的82.5％，在各个站点以及在含Pb(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)、Co(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)的选择性培养基中均能够分离得到，说明芽孢杆菌是深海重金属抗性菌中不可忽视的一大类群。抗性研究结果表明，菌Pb26(Staphylococcussaprophyticus)对重金属锰(Ⅱ)有较高的抗性，最小抑制浓度为30mM，而且具有较高的去除率，在含10mMMn2+的高盐LB中，28℃，200rpm培养过夜后，能够去除培养基中90％的Mn2+，具有对Mn2+的积累作用，通过PCR反应，克隆到Mn(Ⅱ)积累相关的运输蛋白Nramp的编码基因，系统发育分析显示它与现已报道的Nramp相差较大。另外，在东太平洋样品中分离得到菌株Ni5(Exiguobacteriumaurantiacum)，对Cr(Ⅵ)具有较高的抗性，最小抑制浓度为2mM，通过PCR反应，克隆到Cr(Ⅵ)抗性相关蛋白ChrA的编码基因，系统发育分析显示它与现已报道的ChrA相差较大。 另外，在南海样品中筛选得到一株细菌NCD-5，16SrDNA序列比对和GC含量测定显示该菌为Brevibacteriumsanguinis。NCD-5对Cr(Ⅵ)具有较高的抗性和较强的还原能力。 该菌在含1mMCr(Ⅵ)的培养基中生长没有任何抑制，最小抑制浓度为6mM。在有铬诱导和无铬情况下全菌蛋白检测差异，发现一条18.4KDa左右的差异蛋白，质谱分析可能是ABC运输蛋白，可能与菌株对Cr(Ⅵ)的抗性有关。 菌NCD-5在含1mMCr(Ⅵ)的的高盐LB中，30℃、200rpm培养48h能够去除99.63％Cr(Ⅵ)。生理生化特性分析表明，10％的NaCl对NCD-5的生长无影响；NCD-5的最适生长温度在25℃到40℃，最适pH在6-8之间。对它的细胞提取物的Cr(Ⅵ)还原活性的研究表明，它还原酶活性是0.44mmol/mg蛋白/min，CFE的Cr(Ⅵ)还原的最适pH为7.5，最适温度为40℃，电子供体NADH优于NADPH，NADH存在的情况下，铬还原率是NADPH存在下的1.88倍。Cu2+、Mn2+、Cd2+、Ni2+可以使Cr(Ⅵ)还原活性上升，Hg2+使CFECr(Ⅵ)还原活性下降，但幅度很小，Co2+、pb2+对Cr(Ⅵ)还原活性影响很小。这些性质都与已报道的好氧细菌的Cr(Ⅵ)还原酶不同，NCD-5可能产生一种新的Cr(Ⅵ)还原酶。

目录

文摘

英文文摘

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1前言

1.1海洋微生物资源

1.2海洋细菌

1.3深海重金属抗性细菌

1.4细菌的分类和鉴定方法

1.4.1DNA碱基比例(G+C mol %)

1.4.2rRNA 序列分析

1.4.3重复片段PCR基因指纹分析

1.5重金属污染以及微生物对重金属的抗性和解毒机理研究概况

1.5.1重金属污染概况

1.5.2微生物对重金属抗性和解毒机理

1.6本论文的思路、目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1样品

2.1.2试剂盒

2.1.3工具酶

2.1.4主要试剂

2.1.5菌株和质粒

2.1.6主要仪器

2.1.7寡核苷酸

2.1.8分析软件

2.1.9常用溶液和培养基

2.2基本方法

2.2.1质粒的少量制备

2.2.2琼脂糖凝胶电泳

2.2.3细菌DNA的小量制备

2.2.4PCR产物纯化

2.2.516S rDNA的连接与转化

2.2.6全菌蛋白提取

2.2.7SDS-PAGE和质谱检测

2.2.8测定铬还原活性

2.2.9重金属含量的测定

2.2.10G+C mol %含量的测定

3结果和分析

3.1海洋重金属抗性菌的筛选、鉴定和部分重金属抗性相关基因的克隆

3.1.1低深度重金属抗性菌的筛选、鉴定

3.1.2海洋重金属高抗性菌的筛选、鉴定

3.1.3重金属抗性菌抗性能力的测定

3.1.4抗性相关基因的克隆

3.1.5讨论

3.2铬还原菌NCD-5特性的研究和还原机制的初探

3.2.1菌株NCD-5的特性

3.2.2菌NCD-5对Cr(Ⅵ)的抗性和还原机制初探

3.2.3菌NCD-5对Cr(Ⅵ)的抗性和还原能力

3.2.4菌株NCD-5铬还原活性的研究

3.2.5讨论

4小结和展望

参考文献

附录 深海重金属抗性细菌筛选与鉴定的详细结果

攻读硕士期间发表和待发表的论文

致谢