悬浮培养大豆细胞高产植物雌激素成分的研究

摘要

更年期的妇女，由于卵巢功能减弱，雌激素分泌不足，容易导致骨质疏松、心血管疾病等更年期综合症的发生。采用雌激素替代疗法可以缓解更年期综合症，雌激素通过调节平滑肌张力和脂代谢降低心血管疾病的发生，对心血管系统有保护作用。然而，长期使用动物雌激素有较大的副作用，会增加患子宫内膜癌、乳腺癌的风险。近年来研究发现异黄酮等植物次生代谢物具有与雌二醇相类似的结构，能够与雌激素受体结合，表现出雌激素样作用，这类物质称为植物雌激素。和动物雌激素(主要为雌二醇)相比，植物雌激素对血管壁和生殖器官上的雌激素受体具有不同的选择性结合能力，所以对生殖系统的副作用较小，不但能够缓解妇女更年期综合症，而且会减少子宫内膜癌和乳腺癌的发病几率。这一领域的研究为人类寻觅有效而安全的雌激素替代天然药物提供了新的线索和思路。异黄酮类物质大量存在于豆科植物及其产品中，但利用栽培资源植物提取该成分不仅需要占用大量耕地、植物生长周期较长，而且还要受地域和气候等多种环境因素的限制。利用植物细胞培养技术来生产植物代谢产物则可以克服上述限制，为人类获得天然物质提供一条新途径。 本文运用组织培养技术，诱导了大豆愈伤组织，并建立了大豆悬浮细胞培养体系，从悬浮细胞中提取大豆异黄酮，有利于扩大植物雌激素的来源。同时我们研究了异黄酮合成前体物苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)、次生物质有效诱导子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MJ)及蔗糖(Sucrose，S)和二甲亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)对大豆悬浮细胞中异黄酮积累的影响。主要包括以下几个方面： 　　1.大豆种子经消毒后，在培养基上萌发并长出无菌苗，取其下胚轴为外植体诱导愈伤组织。诱导条件为：MS+2,4-D 0.8mg/L+琼脂0.8％，暗中培养，温度(25±1）℃。可在15天诱导出愈伤组织，白色或淡黄色，继代培养后，建立了悬浮细胞系；以子叶为外植体，诱导愈伤组织，诱导条件为：MS+2,4-D5.0mg/L+琼脂0.8％，暗中培养，温度(25±1)℃，可在第5天诱导出愈伤组织，块大、细胞松散、白色或淡黄色，继代培养后，可建立悬浮细胞系。 　　2.培养基中加入BA不利于子叶愈伤组织的形成；以下胚轴诱导愈伤时，BA的存在导致愈伤组织坚硬，细胞致密，不利于形成悬浮细胞。 　　3.以每克干重计算，愈伤组织和悬浮细胞中的异黄酮含量均高于种子中。种子中总异黄酮含量为：1.55mg/g，悬浮细胞中总异黄酮含量为4.88mg/g，是种子的3.15倍。　　4.经筛选确定：有利于大豆悬浮细胞中总异黄酮积累的最佳培养条件为：MS+2,4-D 0.8mg/L，暗培养，转速120r/min。 　　5.在对数生长期末期(第6天)加入DMSO，48h后收获细胞，有利于总异黄酮的积累，含量为7.54mg/g，是对照悬浮细胞总异黄酮含量的1.6倍，是种子总异黄酮含量的4.9倍；获取大豆素的最佳培养条件为：45g/t，蔗糖作用于大豆素悬浮细胞72h；大豆悬浮细胞中加入10umol/L的苯丙氨酸不仅有利于大豆素积累，而且对染料木素的积累有一定作用，48h时处理组表现为对照的120％；茉莉酸甲酯在24h内有利于大豆悬浮细胞中总异黄酮的积累，随时间延长，则抑制细胞的生长，且易导致细胞褐化死亡。

目录

论文说明：本文缩写词

声明

摘要

前言

1植物雌激素的研究概述

2植物组织培养和悬浮培养的研究

3本论文的研究内容和意义

第一章大豆愈伤组织诱导和悬浮培养细胞系的建立

1材料与方法

2结果分析

3讨论

第二章前体和诱导子对悬浮培养细胞中异黄酮积累的影响

1材料与方法

2结果分析

3讨论

总结

参考文献

致谢