热休克蛋白Hsp70ATP-ADP转换活性及分子伴侣功能研究

摘要

热休克蛋白是细胞受热等因素刺激后诱导产生的蛋白质，是在生物进化中高度保守的蛋白质分子家族，广泛存在于从原核到真核各种生物细胞内，后来研究证明热休克蛋白在正常生理条件下亦表达并起重要作用，其作为分子伴侣参与未折叠新生多肽链、多蛋白复合物的组装和跨膜运输、转位、蛋白质降解，细胞内蛋白质合成后的加工等一系列生物活动，保护细胞生存。 Hsp70是热休克蛋白家族中最重要的一员，其诱导性显著，合成量较多。Hsp70功能发挥可能依赖ATP的结合、ATP-ADP的转换或Hsp70的自身磷酸化所引起构象的变化，进而引起的底物结合和释放。Hsp70蛋白家族具有一个共同的三级结构：N端高度保守ATPase功能域和C端底物结合功能域。Hsp70N端44-kD的ATPase功能域存在微弱的ATP水解活性，后来发现Hsp70不仅存在ATP水解活性还存在ATP合成活性，Hsp70表现的是ATP-ADP转换活性。 本实验首先以牛脑Hsp70为研究对象，确定Hsp70 ATP-ADP转换活性发生部位。用糜蛋白酶酶切Hsp70，获得了稳定的44-kD片段，用C14标记的[14C]ATP生成[14C]ADP的量测定ATPase活性；反过来由[14C]ADP生成[14C]ATP的量测定ATP合成酶活性。为获得准确的结论排除NDP激酶可能对实验的影响，按照纯化Hsp70 44-kD片段的方法对等物质量NDP激酶和Hsp70混合物进行酶切、纯化，检测得到的44-kD片段的ATP-ADP转换活性，确定Hsp70 ATP-ADP转换活性是：Hsp70自身固有的，位于其N端44-kD片段处。 Hsp70与NDP激酶相似通过形成酸或碱不稳定自身磷酸化中间体催化γ-磷酸基团在ATP和ADP间传递。本实验研究了酸稳定的磷酸中间体的生成。纯化后的Hsp70、44-kD蛋白片段与标记的[γ-32p]ATP反应，SDS-PAGE后在酸性条件下处理凝胶，Hsp70与44-kD蛋白片段的放射自显影图谱都显示酸稳定的自身磷酸化，推测可能是丝/苏氨酸磷酸化。用CNBr裂解磷酸化的44-kD蛋白片段，磷酸化片段位于裂解后的12-kD片段，氨基酸测序为Lys128-Met237。赖氨酰肽链内切酶酶切、反相分离、氨基酸测序确定磷酸化位点为204位苏氨酸，与大肠杆菌Hsp70---DnaK的199位苏氨酸磷酸化一致。 人Hsp70与牛Hsp70无论氨基酸序列还是三级结构都存在高度同源性。本实验选择人Hsp70中两金属结合位点的3个氨基酸来研究其对Hsp70功能的影响及作用机理。Lys71、Thr204.和His227分别位于ATPase功能域两金属结合位点内，测定Hsp70K71A、T204A突变体ATP-ADP转换活性发现二者ATP-ADP的转换活性几乎完全丧失，无磷酸化中间体的形成。用变性荧光素酶的重折叠实验检测Hsp70的分子伴侣功能，Hsp70K71A、T204A突变体体外帮助变性荧光素酶的重折叠功能受到抑制。H227S突变体的ATP-ADP的转换活性几乎完全丧失，但是其磷酸化中间体未受影响，而且体外帮助变性荧光素酶的重折叠功能比野生型Hsp70稍有降低。ADP部分抑制了野生型Hsp70变性荧光素酶的重折叠，但是对第二个金属结合位点的H227S突变体的重折叠功能没有影响，进一步证实第二个金属结合位点可能与ADP结合相关。

目录

声明

摘要

1前言

1.1热休克蛋白

1.2 Hsp70基因与蛋白结构特点

1.3 Hsp70与ATP-ADP转换关系

1.4 Hsp70的主要功能

1.5 Hsp70在疾病研究上的应用

1.6本实验的目的及意义

2材料和方法

2.1材料

2.2实验方法

3结果

3.1样品的处理

3.2牛脑Hsp70研究

3.2.1牛脑Hsp70 ATP-ADP转换活性部位研究

3.2.2 NDP激酶对Hsp70 44-kD片段酶活性的影响

3.2.3 Hsp70酸稳定磷酸化片段的检测

3.2.4 44-kD片段酸稳定磷酸化位点检测

3.3人Hsp70研究

3.3.1野生型及突变体Hsp70原核表达

3.3.2圆二色谱分析

3.3.3野生型及突变体Hsp70 ATP-ADP转换活性分析

3.3.4野生型及突变体Hsp70磷酸化检测

3.3.5野生型及突变体Hsp70体外助折叠功能及ADP对其影响

4讨论

4.1 Hsp70 44-kD片段ATP-ADP活性及磷酸化

4.2 Hsp70野生型及突变体ATP-ADP活性及助折叠功能

参考文献

致谢

在学期间发表论文及参加的课题