中国沿海几种典型微型硅藻的形态、遗传差异与系统进化研究

摘要

微型浮游硅藻是浮游植物中的重要类群，也是一类重要的海洋生物资源，但同时有些种类会引发赤潮，其中硅藻门的骨条藻属Skeletonema、海链藻属Thalassiosira、角毛藻属Chaetoceros等是比较常见的赤潮藻类。对这些重要的优势微型浮游硅藻种类的分类鉴定和遗传特性的研究，特别是分析这些典型种类的遗传地理差异，了解属内种间的遗传多样性，成为了海洋生态和赤潮研究的基础。 本文以我国沿海典型微型浮游硅藻属—骨条藻、海链藻、角毛藻的常见种类为研究对象，先分离并建立各个种的无菌纯种培养；然后利用光学显微镜、透射电镜和扫描电镜对其进行形态学观察、特征描述，并进行分类研究；再选择核糖体SSUnrDNA和LSUnrDNA基因对其进行分子生物学分析，包括基因序列差异性分析、遗传多样性分析和系统进化分析。旨在对我国沿海几种典型微型浮游硅藻进行形态学分类和分子鉴定，并分析其种间、种内、不同地理株系的地理遗传差异性和系统进化关系，探明我国沿海主要微型浮游硅藻的种类和遗传多样性水平。 本论文主要结果如下： 1、四种骨条藻的形态学、遗传差异及系统进化分析 分析了分离自深圳、香港、青岛、北黄海、厦门、长江口、广州和韩国等地的21株骨条藻。根据其形态学特征，鉴定为4个种：玛氏骨条藻SkeletonemamarinoiSarnoetZingone，多恩骨条藻SkeletonemadohrniiSarnoetKooistra，敏盐骨条藻Skeletonemasubsalsum(Cleve)Bethge和热带骨条藻SkeletonematropicumCleve。分析其nrDNA序列，并构建系统进化树，结果表明，热带骨条藻和敏盐骨条藻为单系的，而玛氏骨条藻和多恩骨条藻没有被区分开。因为玛氏骨条藻和多恩骨条藻种间差异非常小，SSUnrDNA序列的相似性非常高，整个序列相似性≥99.62％，而其它种类间的序列相似性在98.37％～98.93％之间。这两个种LSUnrDNA序列相似性≥99.11％，明显高于其它几种间的序列相似性(92.47％～96.3％)。 2、八种海链藻的形态学、遗传差异及系统进化分析 研究了分离自香港、海口、舟山、台湾海峡、胶州湾等地的20株海链藻。根据形态学特征鉴定为8个种，分别为极小海链藻ThalassiosiraminimaGaarder、威氏海链藻Thalassiosiraweissflogii(Grun．)Fryxell&Hasle、园海链藻ThalassiosirarotulaMeunier、细弱海链藻Thalassiosirasubtilis(Ostenfele)Gran、双环海链藻ThalassiosiradiporocyclusHasle、假微型海链藻ThalassiosirapseudonanaHasleetHeimdal、萎软海链藻ThalassiosiramalaTakano和艾伦海链藻ThalassiosiraalleniiTakano。nrDNA序列和系统进化树分析结果表明，支持细弱海链藻、假微型海链藻、极小海链藻、艾伦海链藻、威氏海链藻、萎软海链藻和双环海链藻为单系起源。威氏海链藻是8种海链藻中最早分歧的谱系，这说明威氏海链藻与其它7种海链藻遗传距离较大、亲缘关系较远。细弱海链藻和假微型海链藻的亲缘关系比较近。两个序列分析结果都显示双环海链藻与其它7种海链藻之间的差异最大，种间存在差异最大的两个种是威氏海链藻和双环海链藻(SSUnrDNA，6.57％；LSUnrDNA，12.82％)。差异最小的两个种是圆海链和细弱海链藻(SSUnrDNA，1.52％；LSUnrDNA，1.71％)。两个序列结果都表明细弱海链藻与假微型海链藻序列差异不大(2.00％～2.60％)。SSUnrDNA基因序列分析中，海链藻种内序列差异从0.13％到2.53％，LSUnrDNA基因序列分析的海链藻种内序列差异与SSUnrDNA基因序列分析中的结果相一致。 3、两种角毛藻的遗传差异及系统进化分析 对分离自香港、海口、黄海和厦门的4株角毛藻(形态学鉴定为2个种，旋链角毛藻ChaetoceroscurvisetiusCleve和短孢角毛藻ChaetocerosbrevisSchütt)进行遗传差异和系统进化分析。结果表明，SSUnrDNA基因序列分析中，旋链角毛藻与短孢角毛藻间的种间差异性为6.64％到10.77％，而旋链角毛藻种内的差异为0.18％到0.59％。角毛藻的SSUnrDNA基因组内存在多态性，旋链角毛藻的基因组内多态性平均为0.45％。LSUnrDNA基因序列分析中，短孢角毛藻与旋链角毛藻间的种间差异从17.15％～19.42％。而旋链角毛藻不同的地理株系也存在一定的遗传差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1微型硅藻的研究意义及我国的研究概况

1.2几种典型微型硅藻的分类研究

1.2.1骨条藻的分类研究

1.2.2海链藻的分类研究

1.2.3角毛藻的分类研究

1.3近年来我国由骨条藻、海链藻和角毛藻引发的赤潮研究

1.4海洋浮游植物遗传多样性分析所用的nrDNA序列

1.4.1 nrDNA序列简介

1.4.2 nrDNA基因在分子鉴定及系统学研究中的优点

1.4.3 nrDNA序列在海洋浮游植物分类中的应用

1.4.4系统发育学相关的概念

1.5本论文的主要内容和研究意义

第二章 材料和方法

2.1自然样品的采集与藻株的分离、纯化

2.1.1样品的采集

2.1.2藻株的分离、纯化和培养

2.2主要试剂和仪器

2.2.1主要试剂

2.2.2主要培养基及溶液配制

2.2.3仪器

2.3方法

2.3.1实验藻种培养

2.3.2形态学鉴定方法

2.3.3基因组DNA的提取

2.3.4 DNA浓度和纯度的检测

2.3.5 LSU nrDNA片段的PCR扩增、纯化

2.3.6 SSU nrDNA片段的PCR扩增、纯化

2.3.7感受态细胞的制备

2.3.8连接反应

2.3.9转化与培养

2.3.10质粒DNA提取

2.3.11测序、数据处理及系统进化分析

2.4本实验的技术路线

第三章四种骨条藻的形态、遗传差异及系统进化分析

3.1实验所用的藻株

3.2实验所用藻种的形态学描述

3.3四种骨条藻SSU nrDNA片段的扩增及序列分析

3.3.1 SSU nrDNA目的基因片段PCR扩增

3.3.2 SSU nrDNA序列碱基组成和替换特征

3.3.3骨条藻SSU nrDNA基因序列差异

3.3.4骨条藻SSU nrDNA遗传距离分析

3.3.5骨条藻地理遗传多样性分析

3.3.6基于SSU nrDNA序列构建骨条藻系统发育树

3.4四种骨条藻LSU nrDNA片段的扩增及序列分析

3.4.1 LSU nrDNA目的基因片段PCR扩增

3.4.2 LSU nrDNA序列碱基组成和替换特征

3.4.3骨条藻LSU nrDNA基因序列差异

3.4.4骨条藻LSU nrDNA遗传距离分析

3.4.5骨条藻地理遗传多样性分析

3.4.6基于LSU nrDNA序列构建骨条藻系统发育树

3.5讨论与小结

3.5.1骨条藻两个序列片段特征比较

3.5.2四种骨条藻在nrDNA水平上的差异

3.5.3骨条藻的地理遗传多样性分析

3.5.4四种骨条藻物种之间的系统发育关系

第四章 八种海链藻的形态、遗传差异和系统发育

4.1实验所用的藻株

4.2实验所用藻种的形态学描述

4.3八种海链藻SSU nrDNA片段的扩增及序列分析

4.3.1 SSU nrDNA目的基因片段PCR扩增

4.3.2 SSU nrDNA序列碱基组成和替换特征

4.3.3八种海链藻种内和种间SSU nrDNA基因序列差异

4.3.4遗传距离分析

4.3.5同种海链藻的地理遗传多样性分析

4.3.6基于SSU nrDNA序列构建海链藻系统发育树

4.4八种海链藻LSU nrDNA片段的扩增及序列分析

4.4.1 LSU nrDNA目的基因片段PCR扩增

4.4.2 LSU nrDNA序列碱基组成和替换特征

4.4.3八种海链藻种间和种内LSU nrDNA基因序列差异

4.4.4遗传距离分析

4.4.5同种海链藻的遗传多样性分析

4.4.6基于LSU nrDNA序列构建海链藻系统发育树

4.5讨论与小结

4.5.1海链藻两个序列片段特征比较

4.5.2八种海链藻在nrDNA水平上的差异

4.5.3海链藻地理遗传多样性分析

4.5.4八种海链藻物种之间的系统发育关系

第五章 两种角毛藻的形态、遗传差异及系统进化分析

5.1实验所用的藻株

5.2实验所用藻种的形态学描述

5.3两种角毛藻SSU nrDNA片段的扩增及序列分析

5.3.1 SSU nrDNA目的基因片段PCR扩增

5.3.2 SSU nrDNA序列碱基组成

5.3.3两种角毛藻种内和种间SSU nrDNA基因序列差异

5.3.4遗传距离分析

5.3.5旋链角毛藻的地理遗传多样性分析

5.3.6基于SSU nrDNA序列构建角毛藻系统发育树

5.4两种角毛藻LSU nrDNA片段的扩增及序列分析

5.4.1 LSU nrDNA目的基因片段PCR扩增

5.4.2 LSU nrDNA序列碱基组成

5.4.3两种角毛藻种内和种间LSU nrDNA基因序列差异

5.4.4遗传距离分析

5.4.5旋链角毛藻地理遗传多样性分析

5.4.6基于LSU nrDNA序列构建角毛藻系统发育树

5.5讨论与小结

5.5.1角毛藻两个序列片段特征比较

5.5.2两种角毛藻在nrDNA水平上的差异

5.5.3旋链角毛藻地理遗传多样性分析

5.5.4两种角毛藻物种之间的系统发育关系

第六章 总结与展望

6.1总结

6.2本研究的特色

6.3有待进一步研究的问题

参考文献

攻读博士期间发表的论文和参加的课题

致谢