马尾松内生真菌诱导植物对病原菌的抗性及其作用机制的研究

摘要

植物内生真菌在植物组织内部这个特殊的生境中生存，在与宿主植物的长期进化中形成了互利共生的关系。研究表明，植物内生真菌能够提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抗性，促进宿主植物的生长。近年来，由于木本植物重要的经济价值和病虫害的频繁发生，宿主—内生真菌的相互关系及其生态意义日益受到人们的关注。本文以我国南方特有的经济林裸子植物马尾松(Pinusmassoniana)为材料，进行了马尾松内生真菌和猝倒病病原镰刀菌(Fusariumsp．)的分离和鉴定；同时以无菌苗为材料，初步研究了部分内生真菌诱导马尾松对猝倒病病原镰刀菌的抗性作用及其机制。 从福建省厦门市仙岳山、同安区翔安农场以及狐尾山和山东省淄博市沂源县东里镇打虎峪村后山以及院峪村后山五个采样地点采取马尾松样本，经表面消毒分离得到303株丝状真菌。对其中215株真菌进行了形态观察和ITS测序鉴定，马尾松内生真菌包括了子囊菌门、接合菌门和担子菌门3个门23个属的真菌，种类十分丰富。其中拟茎点霉(Phomopsissp．)和曲霉(Aspergillussp．)为主要的属，分别占供鉴定菌株的46.51％和17.67％，其它优势属还包括Penicilliumsp．(7.91％)、Guignardia(4.65％)、Botryosphaeria(3.26％)和Fusarium(2.33％)等。 为了验证马尾松内生真菌的内生性和诱导抗性作用，本研究建立了马尾松种苗“套管”培养的无菌系统；同时通过各种马尾松种子内生真菌消除方法和马尾松表面消毒方法的比较实验，优化了消除马尾松种子内生真菌的最适方法和回接实验中马尾松内生真菌再分离的表面消毒方法。 在31株内生真菌的回接实验中，8株真菌(HG09、XY20(2)、XY30、TJ16、HG17、HZ08、TZ16和XY24)的再分离率均≥50％，通过再分离菌株的rDNAITS序列比对分析，证明了这些菌株是马尾松的内生真菌，并通过植物组织的苯胺兰染色和扫描电镜观察，对其中部分菌株的内生化进行了验证。 综合考虑菌株对植物生长的影响因素，选取HG09、XY20(2)、XY30、TJ16、HG17、HZ08、TZ16和HZ40菌株作为诱导马尾松抗猝倒病抗性的试验菌株，同时以镰刀菌P7菌株为猝倒病病原，通过菌悬液涂抹法和菌丝平板接种法接种马尾松，进行过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性测定。从中选出3株诱导抗性结果突出的菌株HG17、XY30和TZ16，以牙签接种法接种马尾松，再次进行POD和PPO活性测定，最后选出了对马尾松幼苗的生长有明显促进作用、抗猝倒病效果显著的曲霉XY30作为进一步的研究菌株。 本论文较为详细地研究了XY30菌株诱导马尾松对猝倒病病原镰刀菌P7产生抗性的作用。分别测定了用菌悬液涂抹法和牙签接种法接种XY30对马尾松POD、PPO和CAT酶活的影响，并且应用蛋白质组学技术初步探讨了内生真菌接种后马尾松蛋白组学的变化，发现差异蛋白主要属于三类，他们分别与植物光合作用、植物生长和植物体内的蛋白质合成有关。 综合本论文研究结果，证明了马尾松植物的组织中确实存在着丰富的内生真菌资源；同时也初步证明了内生真菌接种马尾松后，能够诱导马尾松植物体内的多种抗性酶活的提高以及蛋白组的变化，从而对猝倒病病原镰刀菌产生抗性，促进植物生长。