酿酒葡萄内生真菌、次生代谢产物初步研究

摘要

20世纪90年代以后，植物内生真菌研究范围扩大，不再仅限于禾本科植物，开始倾向从木本植物体内分离内生真菌，研究其生物多样性、生物学作用、内生机理、与宿主之间的关系以及新型活性化合物研究等。 本文对一个引种实验葡萄园中酿酒葡萄的内生真菌资源进行调查，分析其群落构成和种群系统发育关系，对这些菌株的抗植物病原真菌、抗人类病原菌活性进行了初步研究；对活性菌株A23的代谢产物进行活性追踪，对其分离纯化得到的化合物进行结构鉴定和抗植物病原真菌活性研究；同时对同一葡萄园的果实所酿造的葡萄酒进行检测，确定分离到的内生真菌代谢产物Enniatin B是否对葡萄酒造成污染。从酿酒葡萄植株的根、枝条、叶片、果实等组织共分离得到内生真菌455株，统计结果显示，内生真菌的种类和数量与宿主健康状况相关，引种成活率较高的植株内生真菌分离率较高，而引种成活率低的植株内生真菌分离率相应很低，分析其群落构成和发育关系，表明Alternaria，Penicillium，Pusarium是优势种群，一些真菌为潜在的植物病原真菌，如Diapor the phaseolorum，Aspergillusoryzae，Pusarium equiseti，Pestalotiopsis，uvicola等；以黄瓜炭疽病菌、棉花黄萎病菌、棉疫霉果腐病菌为指示菌，初筛采用对峙法测定了103株内生真菌的抗菌活性，复筛使用滤纸片法，初筛得到活性菌株30株，占总数的29.1％，复筛显示，有8株菌对短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用超过氨苄青霉素，并且其中13株对3种植物病原指示菌均有抗性，显示了一定的广谱抗性，在这13株菌中，10株属于优势种群。表明酿酒葡萄蕴含丰富的内生真菌资源，优势种群经过种间竞争，通过产生多种活性代谢产物增加宿主的抗病害、抗逆能力。 本文在研究酿酒葡萄内生真菌发育关系时发现一株内生真菌属于虫草属真菌，与文献中报道的昆虫内生真菌Cotdyceps建立系统发育树，表明植物内生真菌Cotdyceps与昆虫内生Cotdycops真菌有较大差异，分别形成独立的类群，在其发育史上可能通过基因调节经历了从植物到昆虫的宿主“跳跃”。菌株A23经过分子鉴定为Pusarium tricinctum(Corda)，本文采用固体培养、有机溶剂提取、分相萃取、柱层析等分离纯化方法从其发酵产物中分离到5个纯的化合物，经过核磁共振等波谱解析确定其中两个化合物的结构相同，为Enniatin B。测定其抗植物病原真菌生长活性，发现Enniatin B有广谱抗性，且活性较好，对黄瓜炭疽病菌MIC为7μg/mL，对棉花黄萎病菌MIC为3μg/mL，对棉疫霉果腐病菌MIC为15μg/mL，显示Enniatin B具有开发成为农用抗生素的潜力。为检测葡萄酒是否被对人类有害的内生真菌代谢产物污染，对采用同一葡萄园收获果实酿造的两种葡萄酒(红葡萄酒和白葡萄酒)。进行高压液相分析，结果显示红葡萄酒内不含Enniatin B，白葡萄酒内则含有Enniatin B，浓度达到11.04μg/mL。表明植物内生真菌及其代谢物有可能通过一定途径进入植物产品，引发食品安全问题。 本研究表明，酿酒葡萄蕴含丰富的内生真菌资源，是研究内生真菌—宿主发育关系的良好工具，同时蕴含着丰富的活性物质，是寻找新型农药和人用抗生素的有效来源；但也可能会产生对人类有害的毒素，并进入人类食品，引发其安全问题，表明植物内生真菌一方面可以提高宿主的抗逆性，为人类提供有益的活性化合物，对人类农、林、牧业生产活动产生积极影响，另一方面植物内生真菌也可能降低农、林、牧业产值、威胁食品安全，对人类生活有双重作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章背景

1植物内生真菌

2内生真菌目前研究热点

2.1新药物以及先导化合物的研究与开发

2.2共生机制

3植物内生真菌的多样性

3.1植物内生真菌生态多样性

3.2植物内生真菌次生代谢产物多样性

4内生真菌的生态作用

4.1植物内生真菌促进宿主植物生长发育

4.2植物内生真菌增强宿主植物抗逆性

4.3其他生物学作用

5植物内生真菌对人类生活的影响

5.1改善人类生活

5.2对人类造成潜在威胁

6酿酒葡萄(Vitis vinifera)及其相关研究背景

6.1酿酒葡萄品种

6.2真菌病害防治

6.3葡萄制品安全

7本论文研究目的

第二章材料与方法

1材料

2方法

2.1技术路线

2.2内生真菌的分离、培养

2.3菌株鉴定及进化树分析

2.4菌株A23的发酵

2.5生物活性的测定

2.6发酵产物的分离纯化和结构鉴定

2.7葡萄酒中enniatin B的检测

第三章结果与分析

1酿酒葡萄内生菌分离结果

1.1酿酒葡萄内生真菌在不同组织的分布

1.2葡萄内生真菌在不同葡萄品种中的分布

2活性检测结果

2.1初筛结果

2.2复筛结果

3葡萄内生菌的分类鉴定

3.1鉴定结果

3.2进化分析

4化合物分离

4.1菌株A23的发酵及培养物处理

4.2主要分离流程

5葡萄酒中enniatin B的检测

5.1标准曲线

5.2 HPLC结果

第四章讨论与结论

1.酿酒葡萄与内生真菌

1.1酿酒葡萄品种与分离率

1.2内生真菌在酿酒葡萄中所表现的生态与种类多样性

1.3内生真菌的生物活性

2.内生真菌的次生代谢产物

2.1酿酒葡萄内生真菌可产生多种活性代谢产物

2.2酿酒葡萄内生真菌产生Enniatin B

3.内生真菌与饲料、食品安全问题

4.结论

第五章存在的问题与展望

1.存在的问题

2.展望

参考文献

致谢

附录