辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒的制备及其在免疫分析中的应用

摘要

本文围绕一种基于二氧化硅纳米颗粒的免疫酶标记物的制备方法展开。酶联免疫分析(Enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA)是所有免疫分析方法中应用最为广泛的方法，而基于纳米颗粒作为标记物的免疫分析方法则是一个新兴的研究热点，本论文将这两者结合在一起开展了相关的研究。 第一章为绪论，介绍了酶联免疫分析的研究进展，重点介绍了酶联免疫分析的各种标记放大手段。 第二章是辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒的制备及其在夹心法ELISA中的应用。这一章详细介绍了辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒的及其抗体复合物制备过程，并以乙肝表面抗原为检测模型进行实际应用。我们通过油包水(W/O)型微乳体系，制备了直径为50±5nm的二氧化硅纳米颗粒，以此为载体，制备了抗体—酶—硅纳米颗粒复合物。通过氨基硅烷修饰在硅纳米颗粒的表面引入氨基，然后利用高碘酸钠氧化法将HRP标记在颗粒表面，最后通过氧化葡聚糖的桥接作用将乙肝表面的抗体分子标记到酶标记的纳米颗粒表面。我们考察了三种不同氨基硅烷对于HRP标记效率的影响，利用免疫分析的效果来考察HRP和抗体分子不同的用量对于酶标记二氧化硅纳米颗粒—抗体复合物标记效果的影响。最后在最优的条件下检测乙肝表面抗原，其灵敏度达到0.06ng/mL，线性范围0.15—12.5ng/mL，对260份血清样品的检测结果与传统的ELISA完全一致，对30份阳性血清样品的检测结果与传统ELISA相关性良好，相关系数r为0.992。 第三章介绍了辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒在氯霉素检测中的应用，在这一章中通过检测小分子药物氯霉素的实验来考察辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒在竞争型ELISA中应用的可行性。实验中，我们采用了三种不同的免疫分析策略以及两种氨基硅烷制备的酶标记物对氯霉素进行检测。该方法对氯霉素检测的灵敏度最低可以达到0.012ng/mL，而且线性良好。以我们最终选定的策略和标记物进行回收率实验，回收率在85.01％—101.23％之间，CV在6.89％-25.66％，而且与传统的ELISA相关性良好。 综上所述，本论文提出了一种基于二氧化硅纳米颗粒的新型酶标记物及其制备方法。实验证明，与传统的直接将酶分子标记到抗体(或抗原)分子的方法相比，该方法具有操作灵活，过程可控，重复性高，纯化容易，且具有一定的信号放大能力的优点。因此，该标记方法具有极大的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1标记免疫分析技术

1.2酶联免疫吸附分析的研究进展

1.2.1ELISA的基本类型

1.2.2免疫标记酶及其检测方法

1.2.3免疫酶标记技术

1.2.4 ELISA信号放大系统

1.3论文研究设想与目的

参考文献

第二章辣根过氧化物酶标记SiO2纳米颗粒的制备及其在夹心型ELISA中的应用

第一节引言

第二节材料与方法

2.2.1材料

2.2.2仪器

2.2.3 SiO2纳米颗粒的制备

2.2.4 SiO2纳米颗粒表面氨基修饰

2.2.5氨基硅烷原子链对HRP标记效率的影响

2.2.6HRP和葡聚糖的氧化

2.2.7 HRP标记SiO2纳米颗粒的制备

2.2.8抗HBsAg-IgG修饰HRP标记SiO2纳米颗粒

2.2.9 HRP和IgG用量对标记效果的影响

2.2.10基于纳米颗粒的ELISA法检测HBsAg

第三节实验结果

2.3.1 SiO2纳米颗粒的制备及氨基化

2.3.2 HRP标记SiO2纳米颗粒及其抗体复合物的制备

2.3.3氨基硅烷原子链长度对HRP标记效率的影响

2.3.4 HRP和抗体用量对于标记效果的影响

2.3.5HBsAg免疫分析工作曲线

2.3.6方法的精密度考察

2.3.7血清样品分析和相关性实验

第四节讨论

参考文献

第三章辣根过氧化物酶标记SiO2纳米颗粒在竞争型ELISA中的应用

第一节引言

第二节材料与方法

3.2.1材料

3.2.2仪器

3.2.3 BSA-CAP全抗原的合成及全抗原上CAP个数和氨基个数的估算

3.2.5兔抗CAP-IgG的纯化

3.2.6HRP标记SiO2纳米颗粒的制备

3.2.7HRP标记SiO2纳米颗粒-兔抗CAP-IgG复合物的制备

3.2.8HRP标记SiO2纳米颗粒-CAP-BSA复合物的制备

3.2.9 HRP标记SiO2纳米颗粒-CAP-BSA复合物对CAP的非特异吸附考察

3.2.10基于纳米颗粒的ELISA法检测CAP

3.2.12交叉实验

3.2.11牛奶样品的处理

3.2.13回收率实验

3.2.14相关性实验

第三节实验结果

3.3.1TNBS法估算BSA-CAP上CAP的数目和残余的氨基数目和质谱的鉴定

3.3.2 HRP标记SiO2纳米颗粒-兔抗CAP-IgG复合物以及CAP-BSA复合物的制备

3.3.3纳米颗粒对氯霉素的非特异吸附考察

3.3.3基于纳米颗粒的ELISA法检测CAP

3.3.4交叉实验

3.3.5 CAP掺入牛奶样品回收率的考察

3.3.6相关性分析

第四节讨论

参考文献

硕士期间发表交流论文

致谢