H5亚型血凝素单抗库的构建、广谱中和单抗的发现及其对H5N1禽流感的治疗研究

摘要

2003年以来，高致病性H5N1禽流感病毒(H5N1病毒)在禽类中的持续流行和不断发生的人类感染事件使人们担心H5N1病毒可能持续进化成引发人类流感大流行的大流感病毒株。为此，研制H5N1病毒的疫苗和抗体治疗药物成为当前应对H5N1病毒引发潜在流感大流行的研究热点，而H5N1病毒最主要的中和抗体来自于表面糖蛋白血凝素(HA)，因此HA成为主要研究靶标。 H5N1病毒具有高度变异性，故疫苗研制的关键是疫苗株的选择。根据分子进化树分析预测结果显示H5N1病毒HA基因已演变成至少10种不同抗原性特征的变异分支(Clade0-9)。虽然病毒抗血清可真实地反映出病毒的抗原性表现型，但是H5N1病毒新变异株的不断出现和低免疫原性特点使及时制备各种雪貂抗血清变得困难。建立一个H5亚型血凝素单抗库(H5 MAb Panel)，将有助于H5N1病毒新流行株的抗原性变异监测，并指导疫苗株的选择。为此开展了如下工作：(1)利用分子进化树分析1997～2007年分离的114株H5N1病毒的HA基因，并选择位于进化树不同分支的40株H5N1病毒代表株(H5N1 Virus Panel)用于单抗的制备和鉴定；(2)利用Clade1、2.1、2.2、2.3、8等五种变异分支的H5N1病毒免疫和筛选，建立一个包含476株单抗的H5亚型血凝素单抗库；(3)利用血凝抑制试验(HI)分析476株H5单抗对40株H5N1病毒的反应性，把单抗分成九种反应类型(M1-M9)，并发现60株属于M1、M2类的“广谱单抗”能与40株病毒全部或基本全部反应；(4)从中选出15株代表性单抗组成H5 MAbPanel对40株H5N1病毒进行细胞中和试验分析，进一步把15株单抗分成三类，代表H5 MAb三种不同的表位识别特征(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，其中“广谱单抗”属于第Ⅰ类；(5)细胞中和试验结果反映了H5N1病毒的抗原性特征，并把40株H5N1病毒分成四类，代表H5亚型血凝素的四种不同抗原性(A、B、C、D)。A类病毒大部分为Clade2.1(印尼流行株)；B类病毒最具多样性，除了Clade1(越南流行株)，还包括Clade0、4、5、7、8、9等；C类病毒主要为Clade2.2(青海类似株，QH-like)；D类主要是Clade2.3.4(福建类似株，FJ-like)。总之，本研究成功建立了一个H5 MAb Panel，可为H5N1病毒的变异监控、抗原性分析和疫苗株选择更新提供有用的研究工具。 人类感染H5N1病毒具有高致死率，可能原因是病毒感染人体后会迅速扩散到体内多个组织器官，导致严重的并发症。流感病毒传统的抗病毒治疗药物(离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂)对H5N1病毒疗效一般，且疗效依赖于病毒感染早期或感染之前开始用药，而实际临床病人一般都在出现症状的发病中后期才被发现。因此寻找H5N1病毒的治疗新途径势在必行。近年来，被动免疫日益被用于治疗急性传染病，利用中和抗体快速清除体内病毒，因此H5血凝素中和单抗成为治疗H5N1病毒的一种选择。鉴于H5N1病毒HA抗原性存在多种变异分支，理想的治疗单抗应对不同变异分支有广谱疗效。为此在H5N1病毒动物感染模型中对上述获得的H5广谱单抗进行治疗研究：(1)建立了H5N1病毒动物感染模型(BALB/c小鼠和家猫)，确定了病毒对动物的一周致死剂量，鉴定了广谱单抗及其片段在不同动物体内半衰期等生物学性质，选择13D4、13D4F(ab’)2开展治疗研究；(2)在小鼠体内证明广谱单抗13D4对Clade1、2.1、2.2、2.3等已引发人类感染的四种变异分支的H5N1病毒感染均有良好疗效，显示了广谱疗效，而且疗效与单抗给药时间和剂量有关，越早给药，用药剂量越小；(3)组织病毒滴度分离研究显示，广谱单抗在体内能高效清除病毒，使得单抗在病毒引发肺外多器官感染时仍有效，单抗能在病毒感染24小时内将肺组织中的病毒完全清除；(4)利用片段单抗13D4 F(ab’)2治疗H5N1病毒感染鼠，显示疗效不如13D4全抗体，但明显优于抗流感病毒药物奥赛米韦(达菲)；(5)进一步比较不同抗体亚类广谱单抗对H5N1病毒感染鼠的治疗效果，发现IgG2a和IgG2b亚类的疗效明显好于IgG1，而IgM和IgG3亚类无疗效，提示广谱单抗的治疗机制可能与抗体Fc段介导的ADCC、补体激活或免疫调理有关；(6)单抗13D4还对H5N1病毒感染家猫有良好的异源抗体治疗效果；(7)为认识广谱单抗识别的保守表位，利用逃逸突变分析方法鉴定出单抗13D4至少结合两个位点氨基酸(第152位和第182位)，相应突变株对小鼠的毒力均下降，提示这两个位点与病毒受体结合区有关；(8)HI试验显示任意一个点的突变病毒株均不能完全逃避单抗13D4的结合，动物实验显示单抗13D4对逃逸病毒感染鼠虽疗效下降但仍可有效保护。总之，本研究获得的13D4等H5亚型血凝素广谱中和单抗对同源和异源动物感染H5N1病毒均有良好疗效，而且广谱单抗通过结合H5N1病毒血凝素上至少2个保守的关键位点，增强了单抗应对病毒单一突变的治疗能力。