联合靶向HIV-1保守区域以及细胞受体基因的多靶点RNA干扰元件的制备

摘要

RNA干扰技术(RNAi)在HIV-l治疗研究方面已展示出很好的应用潜力。然而，由于HIV-1病毒的高突变率，其在RNAi靶点序列的碱基突变可显著降低或解除RNAi介导的抑制效果。因此寻找有效的抗病毒突变策略是目前RNAi治疗HIV-1研究的重点。多靶点抑制策略有望降低病毒逃逸突变对RNAi治疗措施的影响，本研究即探讨构建可高效靶向HIV-1以及HIV-1细胞受体蛋白的多靶点RNAi元件。 本实验室在之前的研究中，设计了165个靶向HIV-1基因组不同保守区域的siRNA，通过筛选获得了一批能够高效抑制HIV-1的RNAi靶点，包括siRNA-vif37、siRNA-po11102以及siRNA-po11402等，其中siRNA-vif37靶向HIV-1 vif/pol基因的重叠区域，siRNA-po11102、siRNA-po11402靶向HJV-1 pol基因。shRNA表达载体是表达siRNA的常用方式，然而研究显示RNA聚合酶III类启动子介导的shRNA表达量过高，可能导致细胞内源RNAi干扰途径的饱和，引发毒性效应。从miRNA转录本产生siRNA是一种更为理想的方式，miRNA可以通过RNA聚合酶II类启动子介导表达，可以实现低水平及可控表达，有望更好地控制毒性效应。 本研究采用miRNA框架策略，通过将RNAi靶点序列导入mir-155及mir-30a框架，用于构建抗HIV-1的人工miRNA元件。由于siRNA与miRNA的长度存在差异，将siRNA导入miRNA时需要适当补充siRNA靶点序列相邻的碱基以模拟天然miRNA结构达到最佳的抑制效果，本研究构建了具有不同相邻序列的miRNA表达元件，通过共转染抑制实验的筛选获得了可靶向具有较好抑制能力的miRNA元件(mir-v37H、mir-p1102G和mir-p1402B)，进一步进行对不同亚型HIV-1的共转染抑制实验，结果显示上述miRNA元件均能有效抑制不同亚型HIV-1的表达。为了从HIV-1进入细胞的途径上抑制HIV-1感染，本研究选择细胞膜受体CCR5作为抑制HIV-1的补充靶点。CCR5是R5型HlV-1感染细胞的必须辅助受体并且广泛分布于CD4+细胞以及肠粘膜。本研究选择了16个靶向CCR5的RNAi靶点，以mir-30a为基础框架构建miRNA表达元件，通过构建的报告基因筛选系统筛选获得了1个具有较好抑制能力的miRNA元件(mir-CCR13A)。 本研究进一步通过3个人工设计的连接序列地将本研究获得的4个miRNA元件串联起来，获得了多靶点miRNA元件(miCVPP)。本研究采用的连接序列来源于HIV-1 env基因的反义序列。通过对每个靶点miRNA的抑制能力验证，本研究构建的miCVPP可以同时用于表达4个miRNA元件，不同靶点的miRNA均可有效抑制荧光素酶-Target融合报告基因以及HIV-1的表达。 应用重组慢病毒载体系统，本研究构建了携带miCVPP元件的重组慢病毒载体，通过慢病毒载体将miCVPP元件导入HIV-1受体细胞株MT-4，筛选获得了稳定整合miCVPP元件的细胞株MT4-miCVPP。通过荧光半定量PCR方法检测MT4-miCVPP细胞中各靶点成熟miRNA的表达情况，结果显示MT4-miCVPP细胞中miCVPP可以得到有效表达，并分别加工成熟4种单靶点miRNA。进一步对MT4-miCVPP细胞进行干扰素效应、细胞毒性以及细胞增殖检测实验，结果显示携带miCVPP表达元件的MT4-miCVPP细胞生长增殖正常，所携带的RNAi元件未显示出明显的脱靶效应。以高滴度的HIV-1对MT4-miCVPP细胞进行攻毒实验，结果显示MT4-miCVPP细胞相比对照细胞具有更好的抵抗HIV-1感染能力，与携带单靶点miRNA元件的MT-4细胞株相比，MT4-miCVPP细胞可以更持久的抑制HIV-1的表达和复制，从而抑制突变病毒的产生。本研究构建的miCVPP多靶点元件，为进一步开展HIV-1的RNAi基因治疗研究提供了重要的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

前言

1.人免疫缺陷病毒及其治疗的研究进展

1.1艾滋病的流行概况

1.2人免疫缺陷病毒的分子生物学特征

1.3人免疫缺陷病毒的体外培养及动物模型

1.4人免疫缺陷病毒治疗的研究进展

2.人免疫缺陷病毒的基因治疗

2.1 HIV基因治疗策略

2.2基因治疗靶细胞

3.RNA干扰的发现及其抗病毒应用

3.1 RNA干扰的发现及其作用机理

3.2 RNA干扰的特点

3.3 RNA干扰应用研究进展

3.4 siRNA基因治疗所面临的挑战

4.慢病毒载体介导的RNA干扰在HIV-1治疗中的应用

4.1慢病毒载体系统

4.2慢病毒载体介导的RNA干扰

4.3慢病毒载体介导的RNAi应用于HIV-1治疗——进展与挑战

4.4 miRNA基因簇的应用

4.5本研究的思路、目的与意义

材料与方法

1.材料

1.1主要仪器

1.2菌株、质粒、细胞株、病毒株

1.3试剂

1.4常用溶液及培养基配制

2.方法

2.1分子生物学实验方法

2.2细胞生物学实验方法

2.3生化及细胞学检测方法

结果与分析

1.靶向HIV-1 miRNA的设计

1.1靶向HIV-1基因组siRNA的抑制效率及保守性分析

1.2将表达siRNA的shRNA结构替换为miRNA结构的设计思路

2.靶向CCR5 miRNA的设计

3.miRNA表达载体的构建

4.融合有miRNA靶点序列的报告基因表达载体的构建

5.miRNA抑制靶点序列的效果验证

5.1靶向HIV-1 miRNA抑制效果验证

5.2靶向CCR5 miRNA抑制效果验证

6.Multi-miRNA表达元件的设计和构建

6.1 Multi-miRNA表达元件的设计思路

6.2 Linker序列的设计思路

6.3 pcDNA3.1+(Bgl Ⅱ-)的构建

6.4 miRNA-linker融合表达载体的构建

6.5 pcDNA3.1-miRNAL表达载体上miRNA表达活性的验证

6.6多靶点miRNA表达载体的构建

7.miCVPP元件的二级结构分析

8.pLLKK-miCVPP慢病毒转移载体的构建

9.pLLKK-miCVPP对不同亚型HIV-1抑制效果的验证

10.pLLKK-miCVPP对膜受体基因CCR5抑制效果的验证

11.pLLKK-miCVPP抑制特异性分析

12.Lenti-miCVPP重组慢病毒的组装与鉴定

13.稳定表达miCVPP的MT-4细胞的制备

14.MT4-miCVPP细胞株中miRNA元件的表达分析

15.miCVPP的细胞毒性及细胞增殖分析

16.miCVPP的干扰素效应分析

17.重组慢病毒介导的miCVPP在MT-4细胞中的抗HIV-1保护性效果

讨论

1.多靶点RNAi联合抑制HIV-1的优势

2.RNAi抑制HIV-1的靶点选择

3.人工miRNA的设计方法

4.多靶点RNAi元件的构建方法

5.慢病毒载体的优势

总结与展望

参考文献

致谢