人血清转铁蛋白-顺铂的质谱与波谱特性及其靶向诱导肝癌细胞凋亡的分子机制

摘要

外科治疗，放射性治疗(放疗)，化学药物治疗(化疗)、和免疫(生物)治疗是目前癌症治疗的四大主要手段，其中化疗法具有能进行全身性癌症治疗、多发性癌症治疗、以及癌症根治率相对较高等优点，成为应用最广泛、发展最快的治疗手段。但是，传统的化疗药物都不能特异性的杀伤癌细胞，化疗效果和严重毒副作用并存。疗效依赖于药物毒性、给药剂量、给药途径、给药次数和疗程的各种化疗药物均具有细胞毒性极强、给药剂量大，并易产生耐药性等缺陷，给化疗患者带来难以忍受的痛苦。近十年来，高效靶向化疗成为肿瘤治疗学的研究热点之一，在组织器官水平、细胞水平和分子水平上的靶向治疗都有大量的研究报道，部分研究成果已应用于临床治疗。
　　 本文通过小批量制备人血清转铁蛋白(Human serum transferrin，HTF)，通过质谱与波谱特性研究了HTF络合顺铂(Cis-diamminedichloroplatinum，cisplatin/CDDP)能力，构建了HTF-CDDP运输载体，并在体外考察了HTF-CDDP细胞水平的靶向能力，在昆明小鼠体内考察了HTF-CDDP组织器官水平的靶向能力。通过筛选与鉴定HTF-CDDP诱导肿瘤细胞凋亡的差异蛋白质，深入了解HTF-CDDP诱导肿瘤细胞以及肿瘤细胞对CDDP产生耐药性的分子机理，为HTF-CDDP在分子水平靶向凋亡肿瘤细胞的后续研究奠定基础，同时也为传统化疗药物治疗肿瘤疾病提供新思路、新途径和新颖分析技术，立题研究具有重要的科学意义，和潜在应用价值，主要研究内容如下：
　　 第一：HTF制备及异构体分析
　　 采用线性梯度和均匀天然聚丙烯胺凝胶电泳联用的两次电泳技术小批量制备HTF。选用反相液相色谱法(Reverse phase high performance liquidchromatography，RP-HPLC)、阴离子交换色谱法、等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis，IEF-PAGE)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)、肽质量指纹图谱技术(Peptide mass fingerprinting，PMF)等进行HTF及异构体组成分析。结果表明RP-HPLC和IEF-PMF联用技术是最有效的HTF异构体组成分析方法，发现HTF由asialotransferrin、monosialotransferrin、disialotransferrin、trisialotransferrin、tetrasialotransferrin、pentasialotransferrin、hexasialotransferrin、septimsialotransferrin等8个糖链缺失异构体，和HTF-Dchi、HTf-C1、HTf-B2等三个遗传型异构体组成，其中HTF-C1型是主要遗传型异构体，占所有遗传型异构体的95％以上，而带4个糖链分支的tetrasialotransferrin异构体占HTF总量的80％左右，是糖链缺失HTF的主要异构体。
　　 第二：HTF络合CDDP能力的研究
　　 选用圆二色谱(Circular dichroism spectrum，CD)、荧光光谱(Fluorescencespectrum，FS)、红外光谱(Infrared spectrum，IR)、电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)等分析方法研究不同pH值条件下，HTF结构转换趋势和络合CDDP能力。在酸性条件下，反应体系的pH值越低，HTF的结构越松散：当pH<3.5时，HTF分子结构会发生不可逆的变化，但在pH3.5-7.25范围内，其分子结构随pH的变化呈现不同的开放程度。三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)能改善HTF络合CDDP的能力，其络合CDDP数目依赖于反应体系的pH值。建立pH影响HTF络合CDDP能力的反应模型，构建HTF-CDDP复合物，其络合CDDP数量可高达10 CDDP/HTF。
　　 第三：HTF-CDDP靶向HepG2肿瘤细胞能力及其诱导凋亡的分子机制的研究
　　 通过FITC标记HTF-CDDP靶向运输载体，激光扫描共聚焦显微镜技术分析HTF-CDDP靶向及胞饮进入肿瘤细胞的能力，ICP-MS技术分析HTF-CDDP在细胞内外释放CDDP的情况，流式细胞术分析HTF-CDDP靶向肿瘤细胞引起肿瘤凋亡的效果，蛋白质组学及Realtime-PCR技术分析CDDP与HTF-CDDP凋亡HepG2细胞的分子机制差异性等途径，研究CDDP和给药途径对HepG2肝癌耐药性产生的影响。结果表明，HTF-CDDP能够有效的的靶向肿瘤细胞，并与holo-HTF竞争性地与TFR识别与结合，通过胞饮途径进入细胞内释放CDDP，导致肿瘤细胞凋亡，说明HTF-CDDP靶向运输载体能在细胞水平上有效的靶向凋亡肿瘤细胞。Apo-HTF-CDDP和CDDP诱发肿瘤细胞凋亡的分子机制存在差异，主要表现在对ATM/ATR、P73、Akt、BAD、P27、mTOR、GADD45A、53BP1、PCNA和Rad51等关键蛋白/激酶的影响上。同时发现ATM、ATR、Akt等蛋白质是细胞应对CDDP引起DNA损伤后的重要反应蛋白，如何通过抑制这些蛋白的功能，来提高CDDP等DNA毒性化疗药物的抗癌疗效值得深入研究。
　　 第四：TF-CDDP在昆明小鼠体内分布情况
　　 构建昆明小鼠血清转铁蛋白(Mouse serum transferrin，MSTF)-CDDP，并研究MSTF-CDDP和CDDP在昆明小鼠各器官中的分布规律与代谢趋势。在给药后1、3、8、16、24、72h分离昆明小鼠血清、血细胞、肝脏、肾脏、脾脏、肺、心、脑、脊髓和肿瘤等组织，浓硝酸充分消解后用ICP-MS检测各组织的CDDP浓度，分析CDDP和MSTF-CDDP在昆明小鼠体内分布与代谢情况，同时以组织切片技术和透射电镜技术分析CDDP和MSTF-CDDP处理下的肾脏损伤情况。结果表明，pH调节血清转铁蛋白络合CDDP数量的反应模型同样适合于MSTF与CDDP的络合，成功构建了络合10个左右CDDP分子的MSTF-CDDP靶向运输载体；MSTF-CDDP能够通过内吞小泡的形式进入细胞中，表明MSTF-CDDP能够有效的与细胞表面受体结合，并通过TF-TFR胞饮传递系统进入细胞内，进一步证明MSTF-CDDP靶向运输的可能性；MSTF-CDDP能减少CDDP在血细胞中的滞留，是有效提高CDDP药效和降低血液毒性的途径之一；MSTF-CDDP在昆明小鼠体内能够富集于肿瘤组织及大部分内脏器官中，并在内脏器官、肿瘤组织内维持更长时间的高药物浓度，尤其是在肝脏和脾脏组织中，但没有表现出在脑部和脊髓中的富集，不会增强其神经毒性；同时MSTF-CDDP也没有明显的肾脏毒性提高的表现，表明MSTF-CDDP能够在相对低血药浓度(低毒副作用)条件下，在组织器官水平靶向肝脏、脾脏等器官，并在细胞水平靶向肿瘤细胞，对靶向治疗肝脏、脾脏癌症具有巨大潜力。