Importin13蛋白在胚胎小鼠脑组织中的表达及分布研究

摘要

由于真核细胞的基因复制、转录与蛋白质的表达翻译在细胞内分区进行，蛋白质及核酸等生物大分子跨核膜转运成为细胞中最重要的生物学功能之一。Importinβ家族成员是一类真核生物中广泛分布的核质转运受体蛋白。Importin13(Imp13)是这个家族成员之一，也是目前所知的哺乳动物细胞中少数能双向转运底物蛋白的蛋白质之一。目前研究已发现目前研究已发现Imp13的底物有hUbc9,RBM8（也称Y14），Pax3,Pax6,NF-YB/NF-YC,GR,myopodin,negativecofactor2，CHRAC-15/17，p12/CHRAC-17和eIF-1A。这些底物大多与发育有关，因此，Imp13可能在机体发育中有重要的生物学功能。Imp13的表达和在细胞中核质分布的异常可能导致其各种底物发挥的功能受到影响。
　　 为了研究内源Imp13蛋白的表达和分布，我们在本研究中构建了融合表达载体pGEX-4T-2-IPO13，将构建好的表达载体转化大肠杆菌E.coliBL21，诱导表达，把表达的全长Imp13蛋白纯化后做抗原，用其制备抗体，并验证了得到的多克隆抗体的纯度和特异性。用该抗体做WesternBlot，研究Imp13蛋白在小鼠胚胎不同发育时期的表达水平的变化情况。另外，分别提取E13.5，E15.5，E17.5，P0以及成年小鼠的脑组织总RNA，用相对荧光定量RT-PCR的方法，检测IPO13mRNA在小鼠脑组织发育过程的表达变化。荧光定量PCR结果显示IPO13在“C57BL-6”小鼠不同发育时期的脑组织(brain)中的表达随着发育的进程而变化，E13.5IPO13mRNA达到最高峰，其次是E15.5，随后慢慢降低，新生鼠脑组织IPO13mRNA比发育早期相比明显降低，这一结果与WesternBlot的结果相符。
　　 通过对E11.5，E13.5，E15.5，E17.5和P0等各个不同发育时期小鼠脑神经组织进行免疫组化染色，观察发现Imp13蛋白在神经组织细胞内的分布随胚胎的发育过程逐渐由细胞质向细胞核转移。在胚胎发育后期，Imp13蛋白主要集中在细胞核。
　　 在胚胎发育早期，神经上皮细胞不断分裂增殖，分化为成神经细胞。后期成神经细胞迁移、分化为各种类型的神经元细胞。Imp13的分布变化是与脑神经组织发育成熟时间大体并行的，随着脑神经组织在胚胎发育后期进一步分化、成熟，Imp13蛋白逐渐由细胞质向细胞核转移。在本研究中，我发现Imp13蛋白的表达和分布受发育过程的调控，Imp13在神经组织中的功能可能随发育时期的不同而被调控。

目录

声明

摘要

主要英文缩略表

1．前言

1．1 核质转运通路的基本构成和主要结构

1．2 核输入的分子机制以及Importin α／β家族表达和分布的研究现状

1．3 Imp13的结构与功能介绍

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 荧光定量PCR实验

2．3 Western blotting(免疫印迹分析)

2．4 免疫组化

3．结果与讨论

3．1 实时荧光定量PCR可行性验证

3．2 Western Blot检测

3．3 不同发育时期小鼠胚胎(脑)组织切片HE染色

3．4 不同发育时期Imp13蛋白在脑神经组织细胞中的分布

3．5 讨论

3．6 结论

参考文献

致谢